Enzimas para desgomado industrial de aceites vegetales

El desgomado, primer paso del refinado del aceite vegetal, consiste en la remoción de los fosfolípidos y puede realizarse por diferentes métodos. En el desgomado acuoso, método tradicionalmente utilizado, los fosfolípidos son hidratados para generar una emulsión que posteriormente es separada por centrifugación. Esa emulsión, llamada “goma”, contiene aceite atrapado que no puede separarse por centrifugación y representa una pérdida significativa del proceso. El desgomado enzimático utiliza fosfolipasas tipo C para hidrolizar los fosfolípidos, generando diacilglicéridos y productos solubles en agua. Con este método, se logra un aumento en el rendimiento del aceite refinado, no solo al eliminar los fosfolípidos que capturan las moléculas de triacilglicéridos, sino también al generar diacilglicéridos que son recuperados en la fase oleosa. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, se ha desarrollado una mezcla enzimática de fosfolipasas C aplicable al proceso de desgomado enzimático clásico. Sin embargo, el uso de enzimas con mayor termoestabilidad en el proceso daría ventajas ya que reduciría el consumo energético y el impacto medio ambiental, y permitiría el tratamiento de las gomas provenientes del desgomado acuoso al lograr un mezclado más eficiente a altas temperaturas. Dada la necesidad de contar con fosfolipasas C termoestables que permitan recuperar aceite mediante el tratamiento enzimático de gomas o de aceite crudo de soja, en este trabajo de tesis, se propuso obtener variantes termoestables de las enzimas PC-PLC. Mediante una búsqueda in silico a partir de bases de datos de genomas de bacterias termófilas o metagenómica de muestras provenientes de ecosistemas a altas temperaturas, se seleccionaron 15 secuencias de proteínas con potencial actividad fosfolipasa C. Las proteínas recombinantes producidas en Pichia pastoris, fueron evaluadas por su actividad a altas temperaturas y tres de ellas presentaron actividad fosfolipasa C en aceite crudo de soja a temperaturas mayores o iguales a 70 °C. Particularmente, la PC-PLC de Thermococcus kodakarensis (TkPLC) se expresó en mayores concentraciones y presentó actividad por encima de 80 °C. TkPLC presentó actividad entre 80 y 90 ˚C en medio acuoso siendo máxima a 85 ˚C y mantuvo el 100 % de su actividad cuando fue preincubada durante 30 minutos entre 30 y 80 °C. Además, se determinó que TkPLC presenta actividad máxima en el rango de pH 6,0 - 8,0 y se demostró la estabilidad de TkPLC a altas temperaturas en experimentos de desnaturalización por dicroísmo circular presentando una T1/2 10 ˚C mayor a la de la enzima actualmente utilizada en la industria, BcPLC. Mediante reacciones de desgomado de aceite crudo de soja, se demostró que la enzima hidroliza completamente fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina a 85 ˚C, que representan ~70 % de los fosfolípidos presentes en este aceite. Además, se determinó que la concentración mínima requerida para degradar el 100 % de los fosfolípidos en dos horas a 85 ˚C es 10 μg de enzima por gramo de aceite crudo. El rendimiento extra de aceite recuperado en las condiciones definidas es de 1,9 %, similar al informado anteriormente con BcPLC en sus condiciones óptimas de reacción. En cuanto a la termoestabilidad de la enzima en aceite, se observó que TkPLC conserva su actividad a 85 ˚C luego de ser preincubada entre 70 y 100 ˚C durante dos horas. Por otro lado, se propuso recuperar aceite de las gomas obtenidas del desgomado acuoso, como operación separada, permitiendo aumentar el rendimiento y aprovechando el residuo generado mediante el tratamiento con TkPLC a 85 °C. Se demostró que al tratar una mezcla a partes iguales de gomas y aceite crudo con 100 μg de TkPLC por gramo de gomas durante 10 horas es posible recuperar el 43 % del aceite. Como objetivo de la última etapa de este trabajo se planteó mejorar la producción de TkPLC. Para ello, se evaluó comparativamente el uso de dos promotores fuertes (AOX y FMD) y la coexpresión de proteínas auxiliares que asisten al plegado y procesamiento de proteínas en P. pastoris. Combinando estas dos herramientas se obtuvo una cepa que aumenta cuatro veces la producción de TkPLC en cultivos en batch y en cultivos de alta densidad respecto de la cepa inicial. La alta estabilidad térmica de TkPLC y sus propiedades catalíticas, convierten a esta proteína en una candidata prometedora aplicable al proceso de desgomado enzimático a alta temperatura, brindando importantes beneficios industriales, económicos y ambientales. Dada la importancia de este proceso en la economía mundial, por la alta demanda de aceites vegetales comestibles, el uso de TkPLC facilitaría la implementación de esta tecnología a escala global.