Saccharomyces cerevisiae como herramienta para estudiar proteínas del metabolismo de hemo de Trypanosoma cruzi
dc.contributor.advisor | Cricco, Julia Alejandra | |
dc.creator | Cirulli, Brenda Analía | |
dc.date.accessioned | 2019-08-16T17:57:15Z | |
dc.date.available | 2019-08-16T17:57:15Z | |
dc.date.issued | 2018-07-10 | |
dc.description.abstract | El eucariota unicelular Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas (Rassi y col., 2010). Tiene un ciclo de vida complejo que alterna entre dos hospedadores y al menos tres estadios diferentes. Sus necesidades nutricionales incluyen auxotrofía por el grupo hemo, dado que carece de las enzimas necesarias para su síntesis. T. cruzi debe incorporar el cofactor a partir del hospedador mamífero o invertebrado para suplir de hemo a las numerosas hemoproteínas que posee (incluidas las de los complejos de cadena respiratoria mitocondrial) (Korený y col., 2010; Tripodi y col., 2011). La posterior conversión del hemo incorporado a la forma hemo A, cofactor del complejo IV o CcO (citocromo c oxidasa), ocurre a través de dos reacciones enzimáticas secuenciales mediadas por una Hemo O Sintasa (HOS o Cox10) y una Hemo A Sintasa (HAS o Cox15). Ambas enzimas se localizan en la membrana interna mitocondrial en eucariotas y están altamente conservadas (Brown y col., 2002; Zee y Glerum, 2006). En nuestro laboratorio se identificaron las secuencias codificantes para las enzimas del tipo HOS y HAS en el genoma T. cruzi, las cuales se denominaron TcCOX10 y TcCOX15, respectivamente (Buchensky y col., 2010). Respecto al transporte de hemo en eucariotas, éste no está muy bien caracterizado y, particularmente en tripanosomátidos, se desconocen cuáles son las proteínas involucradas y cómo operan aunque en los últimos años se han realizado algunos hallazgos (Horáková y col., 2015; Martínez-García y col., 2016; Merli y Pagura y col., 2016). Por otro lado, Saccharomyces cerevisiae es un organismo eucariota unicelular de vida libre, no patógeno, y es ampliamente utilizado como modelo de estudio biológico de otros eucariotas debido a estas y otras numerosas características que resultan ventajosas a la hora de su manipulación (Karathia y col., 2011). Además es capaz de sintetizar hemo, utilizando una ruta altamente conservada a través de la evolución que culmina en la matriz mitocondrial. También es capaz de sintetizar hemo A mediante las enzimas ScCox10 y ScCox15 mitocondriales. S. cerevisiae posee 3 transportadores de tipo ABC mitocondriales, pero ninguno de ellos es específico para hemo; se denominan Atm1, Mdl1 y Mdl2 (Jungwirth y Kuchler, 2006). En este trabajo de Tesis nos proponemos estudiar proteínas con posible rol en el metabolismo y transporte de hemo mitocondrial de T. cruzi utilizando a S. cerevisiae como sistema modelo. Es así que analizamos la posible función de la proteína codificada por el gen de T. cruzi que denominamos mtTcABCB, homólogo a la proteína de mamíferos ABCB6 involucrada en el transporte mitocondrial de porfirinas. Además, profundizamos el estudio del rol funcional de TcCox10, una de las enzimas de la biosíntesis de hemo A. Respecto al transporte mitocondrial de hemo, se evaluó la capacidad de mtTcAbcB de transportar hemo en mitocondria de S. cerevisiae. Los resultados obtenidos no nos permitieron elucidar la función de mtTcAbcB en mitocondria. Ensayos adicionales nos permitieron descartar su función de transporte de porfirinas en membrana plasmática de S. cerevisiae. La proteína recombinante mtTcAbcB.His-GFP se expresa en levaduras dado que se ha visualizado su fluorescencia intrínseca en el interior de las células. Si bien no podemos inferir sobre la función a la proteína de T. cruzi mtTcAbcB en S. cerevisiae, los resultados obtenidos tampoco nos permiten descartar su probable función como transportador de hemo mitocondrial en T. cruzi. En el análisis de estos resultados se debe considerar que, al ser S. cerevisiae capaz de sintetizar hemo, posiblemente no sea este el modelo adecuado para estudiar el transporte de hemo al interior mitocondrial. Para completar y profundizar el estudio de la enzima HOS de T. cruzi (TcCox10) se construyó una versión recombinante con fusión a GFP, TcCox10.His-GFP. La misma se visualizó intracelularmente en S. cerevisiae en lo que parecen ser vesículas y al menos parte se detectó en mitocondrias. La funcionalidad de TcCox10.His-GFP se demostró mediante ensayos de complementación en placa de células de S. cerevisiae cox10Δ y, de forma complementaria, por medidas de consumo de O2 de las mismas células cox10Δ transformantes. Algunos de los resultados obtenidos indican que la fusión a GFP altera de alguna manera la eficiencia de TcCox10 como HOS y permiten postular un posible modelo de ruta del hemo en S. cerevisiae y en T. cruzi. Un análisis predictivo de los segmentos transmembrana y orientación de cada proteína utilizando distintos algoritmos arroja resultados que también apoyarían este modelo. La expresión de TcCox10.His-GFP en epimastigotes de T. cruzi confirmó la localización mitocondrial de la proteína de fusión. En función de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio tanto con TcCox10 como con TcCox15 (Tesis doctoral del Dr. Marcelo L. Merli) así como los resultados obtenidos en otros grupos de investigación con los transportadores de Leishamania y de T. brucei, consideramos que S. cerevisiae es un modelo válido para el estudio funcional de proteínas de otros organismos eucariotas cuyo ortólogo esté presente también en la levadura, mientras que para el estudio de proteínas con funciones no identificadas en levadura se deben tener en cuenta las limitaciones del modelo. | es |
dc.description.fil | Fil: Cirulli, Brenda Analía. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET); Argentina. | es |
dc.format | application/pdf | |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/2133/15795 | |
dc.language.iso | spa | es |
dc.publisher | Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. | es |
dc.rights | es | |
dc.rights.holder | Cirulli, Brenda Analía | es |
dc.rights.text | Atribución – No Comercial (by-nc): Se permite la generación de obras derivadas siempre que no se haga con fines comerciales. Tampoco se puede utilizar la obra original con fines comerciales https://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.5/ar/ | es |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.5/ar/ | * |
dc.subject | Saccharomyces | es |
dc.subject | Hemo | es |
dc.subject | Trypanosoma cruzi | es |
dc.title | Saccharomyces cerevisiae como herramienta para estudiar proteínas del metabolismo de hemo de Trypanosoma cruzi | es |
dc.type | doctoralThesis | |
dc.type | Tésis de Doctorado | |
dc.type | acceptedVersion | |
dc.type.collection | tesis | |
dc.type.other | doctoralThesis | es |
dc.type.version | acceptedVersion | es |