Aplicaciones biotecnológicas de los módulos de unión a carbohidratos de plantas

En la degradación y remodelación de la pared celular intervienen numerosas enzimas y proteínas, y un aspecto común de la estructura de la mayoría de las mismas es su organización modular. Dicha organización incluye típicamente un dominio catalítico característico de cada enzima y uno o más dominios de unión a carbohidratos (CBM). Un CBM es definido como una secuencia contigua de aminoácidos dentro de una enzima activa involucrada en el metabolismo de carbohidratos, que posee la capacidad de unirse a los mismos. Hasta el momento, los CBM más estudiados corresponden a hongos y bacterias y se conoce muy poco de los de enzimas vegetales. Dentro de los CBM se destacan los dominios de unión a almidón (SBD). Desde abril de 2004 nuestro laboratorio trabaja en la caracterización de la almidón sintasa III (SSIII) de Arabidopsis thaliana (AT1G11720). Dicha proteína no había sido clonada ni caracterizada previamente. Los estudios preliminares mostraron que la porción amino terminal es portadora de tres regiones repetitivas con características de dominios SBD, hasta ese momento no descriptos en enzimas vinculadas con la síntesis de almidón, pertenecientes a la familia CBM53. Estudiando la capacidad de unión a distintos polisacáridos (almidón, amilosa, amilopectina, celulosa y xilanos) comprobamos que SBD123 tiene la capacidad de unirse a los cinco polisacáridos, dos de ellos componentes de la pared celular vegetal. Esto refleja la promiscuidad de tales dominios, ya que no sólo se unen a sustratos diferentes de su sustrato natural, sino que lo hacen con mayor avidez. Tales experimentos nos permitieron postular el uso de SBD123 como herramienta biotecnológica para modificar la estructura y/o el contenido de pared celular y de almidón de plantas. Para verificar nuestra hipótesis, se construyeron dos líneas de plantas transgénicas que sobreexpresan el extremo N-terminal de SSIII de A. thaliana específicamente en pared (E8-SBD123.1 y E8-SBD123.2) y que presentaron características fenotípicas destacables. Por lo tanto, se propusieron como objeto de estudio los dominios de unión a almidón (“Starch Binding Domains”, SBD, familia CBM53) de la almidón sintasa III de Arabidopsis thaliana y los CBM de ATXYN1, una endo-1,4-beta-xilanasa también de A. thaliana (familia CBM22). El abordaje fue llevado a cabo, utilizando análisis bioinformáticos, evolutivos e ingeniería de proteínas, así como técnicas moleculares y fisiológicas que nos brindaron información sobre su bioquímica, estructura y función y de su rendimiento o in vitro o in vivo como herramienta biotecnológica. En primer lugar, realizamos una caracterización de los parámetros fenotípicos de las plantas E8-SBD123 observando un aumento general en el tamaño y en la biomasa de dichas plantas en comparación con Col-0, además de una modificación en los parámetros de crecimiento reproductivo (tasa elongación del tallo, proporción de tallo y la longitud del hipocótilo). Estos parámetros se encuentran asociados a la etapa de crecimiento reproductivo, gobernada por la auto-preservación del SAM (meristema apical del tallo) por proliferación celular y la extensión del tallo por expansión celular. Sin embargo, no se observaron diferencias en la longitud del hipocótilo cuando las plántulas fueron sometidas a oscuridad continua. Adicionalmente se determinó que existe un aumento en la tasa de crecimiento, confirmado por técnicas de microscopía óptica. En el caso de las hojas, observamos que un aumento del 20% en el área foliar en las plantas transgénicas puede ser explicado solamente por un aumento del 20% del área celular promedio, no siendo significativa la contribución del número celular. Adicionalmente, observamos alteraciones en la composición de la pared celular de las plantas transgénicas en distintos órganos. Específicamente observamos aumento en los niveles de hemicelulosas y pectinas, los cuales pueden deberse a una respuesta de la planta para soportar las fuerzas de tensión. Por último, detectamos que estas plantas son capaces de producir mayor cantidad de azúcares fermentables en comparación con Col-0. Debido a que utilizamos a los SBD de la SSIII para alterar la estructura de la pared celular, y a que los precursores para la síntesis de celulosa y almidón son compartidos, decidimos evaluar los niveles de almidón transitorio y sacarosa, en hojas de las plantas de A. thaliana transformadas. Para esto, determinamos el contenido de almidón en función del tiempo, encontrando una disminución significativa a mitad del día en las líneas E8-SDB123.1 y E8-SDB123.2. Además, detectamos una variación en la relación amilosa/amilopectina. Por medio de TEM (microscopía electrónica de trasmisión), no pudimos determinar diferencias en el número de gránulos de almidón por cloroplastos, pero si una alteración en la forma y tamaño de los gránulos de almidón. Adicionalmente, se evidenció una disminución significativa en la actividad almidón sintasa total, y un aumento en la actividad de enzimas como la sacarosa sintasa (SUS) y la invertasa ácida (IA) en ambas líneas transgénicas, en comparación con la línea control. De esta forma, proponemos que el aumento en la actividad IA puede actuar como fuerza motriz de la expansión celular informada en las plantas transgénicas, y que tanto la alteración en la composición de la pared, como el aumento en la biomasa observado en las líneas transgénicas, pueden explicar un aumento en la demanda de azúcares en el apoplasto y, en consecuencia, un aumento en la actividad SUS.