Construcción de herramientas biotecnológicas para la detección de glifosato

Abstract

El glifosato (GP), o N-fosfonometilglicina, es un fosfonato sintético de amplio espectro, y sus formulaciones se han convertido en los herbicidas más utilizados a nivel mundial. Este uso masivo, especialmente en regiones agrícolas como la Pampa Argentina, donde se basa la producción en cultivos transgénicos resistentes al glifosato, ha provocado la presencia generalizada de residuos de GP y de su metabolito principal, el ácido aminometilfosfónico (AMPA), en ambientes acuáticos y terrestres. Dada la preocupación sobre los riesgos para la salud asociados al uso de glifosato que fue clasificado por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, del inglés International Agency For Research on Cancer), en el Grupo 2A, posible carcinogénico para humanos, es importante y urgente desarrollar herramientas microbiológicas y moleculares accesibles y robustas para su detección y eliminación. En este contexto, el presente trabajo se enfoca en la explotación de los mecanismos de degradación del GP presentes en bacterias nativas. Previamente, se ha aislado y caracterizado la cepa ambiental Agrobacterium tumefaciens CHLDO a partir de suelos con historial de repetidas aplicaciones de herbicidas basados en glifosato (GBH, del inglés Glyphosate Based Herbicides). Esta cepa se identificó como un degradador altamente eficiente. El análisis de su genoma y los estudios transcripcionales revelaron que la capacidad de A. tumefaciens CHLDO para utilizar GP como única fuente de fósforo se basa en la vía CP liasa, codificada por el clúster génico phn. El clúster phn de A. tumefaciens CHLDO está compuesto por 15 marcos abiertos de lectura, incluyendo los genes responsables de la regulación (phnF), los transportadores (phnCDE2E1) y el núcleo activo del complejo C-P liasa (phnGHIJKLO). La expresión de estos genes se encuentra altamente inducida en presencia de GBH. Haciendo uso de este sistema de respuesta transcripcional, el objetivo principal de este proyecto fue la construcción de herramientas biotecnológicas tipo biosensores basadas en el elemento regulatorio del gen phnC, su promotor. Se propuso el clonado de las regiones promotoras de phnC y mnaT, un gen cuya expresión se induce altamente en presencia de GP, en vectores de la familia pPROBE que contienen el gen de la proteína verde fluorescente (GFP, del inglés Green Fluorescent Protein), así como la evaluación de sus características como biosensores en la cepa ambiental A. tumefaciens CHLDO. Complementariamente, y continuando con el trabajo con detectores y consumidores de GBH, se analizó la degradación por parte de la cepa Achromobacter insolitus en ensayos que replicaron las condiciones a campo, donde la bacteria fue incorporada a tierras contaminadas con GBH y se cuantificó su consumo mediante ensayos de medidas de densidad óptica y fluorescencia, utilizando un biosensor construido en el laboratorio. Los resultados de este trabajo contribuyen a aislar y caracterizar bacterias nativas con alta eficiencia de degradación de GP y han sentado las bases para la obtención de herramientas biotecnológicas robustas que pueden aplicarse a la detección y posible remoción futura de este herbicida del medio ambiente.