Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la susceptibilidad al desarrollo de hepatocarcinoma en modelos experimentales con alteraciones metabólicas como la diabetes mellitus

La diabetes mellitus (DM) supone un desorden metabólico caracterizado por la presencia de hiperglicemia crónica, que se acompaña de alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono, de las proteínas y los lípidos. El origen y la etiología de la DM pueden ser muy diversos, pero conlleva de forma inexorable a la existencia de alteraciones en la secreción de insulina, en la sensibilidad a la acción de la hormona, o en ambas en algún momento de su historia natural. Específicamente la DM es considerada una patología inflamatoria que contribuye al desarrollo de otras enfermedades. Durante la diabetes el hígado está expuesto a altas concentraciones de citoquinas características de un cuadro inflamatorio. Además, los pacientes con DM1 reciben, desde el inicio de la patología, insulina en dosis farmacológicas que puede promover alteraciones en el balance entre proliferación y muerte celular en el hígado. La DM se sitúa entre las primeras causas de muerte en la mayoría de los países desarrollados, debido tanto a la alteración metabólica en sí misma, como a las complicaciones macro y microvasculares derivadas de ella y entre otras a la alteración hepática [26]. Desde hace relativamente poco tiempo se ha sugerido un riesgo dos veces superior de enfermedad hepática en los pacientes diabéticos [27]. El cáncer de hígado es uno de los tumores malignos más comunes en todo el mundo. El carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC) representa alrededor del 80%-90% de todos los cánceres de hígado y es la quinta causa más común de mortalidad [28, 29]. Su incidencia está creciendo drásticamente en el mundo occidental debido al incremento de afecciones hepáticas de base, siendo una de ellas el estado diabético, que produce en el hígado modificaciones que aumentan la sensibilización del mismo a desarrollar HCC [30, 31]. El riesgo de desarrollar HCC se da tanto en pacientes con DM1 como así también en aquellos con DM2 en los cuales la obesidad, el síndrome metabólico y el progresivo desarrollo de esteatohepatitis no-alcohólica, llevaría a la consecuente cirrosis y posterior desarrollo de cáncer. La dietilnitrosamina (DEN) es un conocido y potente agente hepatocarcinógeno [53–55]. La exposición al DEN se ha asociado con la acumulación hepatocelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) [37], lo que puede provocar daños oxidativos en el ADN. Asi mismo se sabe que el DEN induce daño en muchas enzimas involucradas en la reparación del ADN [51, 52, 59, 60]. Teniendo en cuenta lo descripto anteriormente el objetivo de nuestro trabajo fue analizar los posibles mecanismos moleculares involucrados en la sensibilización del hígado en el estado de diabetes mellitus al desarrollo del hepatocarcinoma. En una primera etapa del presente estudio utilizamos ratones C57BL/6 a los que se les administró STZ con el fin de establecer el cuadro diabético (DM1). Los ratones fueron tratados con insulina diariamente y una única dosis no necrogénica de DEN. En este modelo analizamos el balance entre apoptosis y proliferación celular, sabiendo que este balance juega un rol importante en el desarrollo del cáncer [61–63]. Observamos que tanto la apoptosis como la proliferación celular se encuentran modificadas en el estado diabético y frente al tratamiento con DEN, mostrando un desbalance entre ambos eventos, en favor de la proliferación. El hígado de los ratones diabéticos tratados con insulina es más sensible al efecto del tratamiento con DEN, ya que observamos un incremento significativo del índice de proliferación (IP), que favorecería en las células la alteración del ciclo celular, que es esencial, en la etapa temprana, para la transformación maligna. Asimismo, el análisis histopatológico puso de manifiesto lesiones hepáticas promovidas por el estado diabético, siendo muchas de ellas irreversibles. En conjunto, nuestros resultados muestran una mayor sensibilidad hepática al tratamiento con DEN en el estado DM1+I, lo que sugiere que el grado de inflamación crónica, el aumento de los niveles de ROS y las alteraciones en el balance del ciclo celular derivado del tratamiento con insulina, entre otros factores, podrían jugar un papel fundamental en su sensibilización. Por otro lado evaluamos posibles marcadores tumorales tempranos de la iniciación del desarrollo de hepatocarcinoma en nuestro modelo de DM1 inducida por ETZ y tratadas con insulina. Nuestros resultados nos permiten sugerir como posibles marcadores tumorales a: p53 nuclear, VEGF, miR-122, COX-2 y -catenina nuclear. Todas estas variables se encuentran modificadas en el hígado diabético tratado con insulina previo al estímulo con el cancerígeno DEN, de manera que estarían poniendo de manifiesto la predisposición o sensibilización del órgano a desarrollar un tumor ya sea en la progresión misma de la enfermedad o frente a la exposición de agentes cancerígenos. En una segunda etapa, nuestro modelo de estudio fueron ratones C57BL/6 a los cuales se les indujo DM2 mediante una dieta rica en grasa (HFD) y recibieron una única dosis no necrogénica de DEN. Actualmente existen pruebas claras de que la DM2 y el HCC están estrechamente vinculados, debido a su asociación con la obesidad, la sensibilidad a la insulina disminuida y el NAFLD [238]. En nuestro trabajo demostramos que la DM2 inducida por HFD representa un factor de riesgo que aumenta la sensibilidad a la alteración del ciclo celular hepático inducida por DEN, indicada por un aumento en el IP, que es esencial, en las primeras etapas, para la transformación maligna. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que en los hígados de ratones DM2 inducidos por HFD hay niveles nucleares más altos de proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular como la ciclina D1 y la ciclina E1. El análisis histopatológico nos permitió observar alteraciones hepáticas, reversibles (esteatosis) e irreversibles (necrosis), promovidas por la DM2 inducida por HFD, que podría tornar al hígado más susceptible al desarrollo de un HCC por el tratamiento con DEN. Analizamos en nuestro modelo de DM2 inducida por HFD la cascada de señalización de Wnt/-catenina, que es descripta como fundamental en el desarrollo y crecimiento del hígado, así como en carcinogénesis. La acumulación nuclear de - catenina conduce a la activación de reconocidos genes target como Vegf, c-myc, c-jun y ciclina D1 [82, 83, 103]. En base a los resultados obtenidos, demostramos que la DM2 inducida por HFD sensibiliza al hígado, promoviendo la activación de la vía de señalización de Wnt/-catenina. Teniendo en cuenta que el aumento de TGF-1 se ha asociado con un mayor riesgo a desarrollar DM2 [22] y que la vía TGF-/Smads juega un rol fundamental en la iniciación del desarrollo de HCC [136, 156, 235] en nuestro trabajo, analizamos p- Smad 2/3 y Smad4 en la fracción nuclear obteniendo un aumento de las mismas, esto podría implicar un incremento de genes target implicados en el crecimiento celular, supervivencia y metástasis, poniendo en evidencia que esta vía de señalización estaría implicada en una mayor sensibilización del hígado de los ratones DM2 inducidos por HFD, al desarrollo de HCC frente a un estímulo carcinogénico. Una observación potencialmente relevante de nuestro estudio fue que un estímulo de las células con TGF-1 aumentó los niveles de ambas proteínas nucleares p-Smad 2/3 y -catenina, lo que sugiere un posible sinergismo entre estas dos vías de señalización en nuestro modelo. Estos resultados coinciden con autores que han descripto una interacción de ambas vías de señalización a través probablemente de la interacción con TCF-4 [168, 170–172, 245]. En el presente estudio hemos demostrado la existencia de proteínas nucleares y /o citosólicas en el hígado de ratones diabéticos que estarían caracterizando o poniendo en relieve su predisposición a iniciar el desarrollo de un hepatocarcinoma en la evolución de la enfermedad y/o frente a modificaciones predisponentes del medio ambiente.