β-Lactamasas: abordaje de su evolución clínica y desarrollo de inhibidores

Los antibióticos son uno de los grandes hitos que permitieron el desarrollo de la medicina moderna, junto con las vacunas y la mejora en las condiciones de higiene. Sin embargo, su efectividad está siendo fuertemente amenazada por la resistencia bacteriana, a tal punto que el CDC ya ha anunciado el comienzo de la era post-antibióticos. La reciente pandemia del COVID-19 ha agravado y acelerado aún más la problemática. Los antibióticos β-lactámicos son los más frecuentemente prescriptos y vendidos debido a su alta tolerancia y efectividad. Contra ellos el principal mecanismo de resistencia es la expresión de enzimas que los hidrolizan, las llamadas β-lactamasas. Se dividen en dos grupos; las serín-β-lactamasas (SBLs) catalizan la ruptura del anillo β- lactámico mediante un residuo de serina activado y se dividen en 3 clases A, C y D. La clase A son las enzimas más estudiadas y frecuentemente encontradas en ambientes hospitalarios y fuera de él. Las metalo-β-lactamasas (MBLs) para efectuar la catálisis son dependientes de Zn(II). Se dividen en tres subclases, las B1 y B3 poseen un centro di- Zn(II) y las B2 uno mono-Zn(II). Si bien también difieren en su rango de actividad y topología del sitio activo, todas comparten su mecanismo catalítico para la hidrólisis de los carbapenemes. Esta creciente resistencia a antibióticos se ve agravada por dos factores principalmente. Uno de ellos es la ausencia de inhibidores de MBLs, que puedan ser administrados con junto a los antibióticos ya existentes. Estas enzimas clínicas tienen un amplio rango de sustrato y son una de las principales amenazas en ambientes hospitalarios. Por otro lado, otra de las importantes complicaciones de la resistencia a antibióticos es la rápida adaptabilidad y evolución de las β-lactamasas. Esta característica pone en peligro que la introducción en la clínica de nuevos antibióticos o inhibidores se vuelva obsoleta rápidamente. En el presente trabajo de tesis, ambas problemáticas fueron estudiadas. Dado que las tres subclases de MBLs difieren significativamente el diseño de inhibidores de amplio espectro plantea serias dificultades. Sin embargo, al compartir el mecanismo catalítico, la estructura química de cada una de las especies estabilizadas e involucradas en el mismo puede ser empleada para diseñar inhibidores que las imiten. Previamente se habían reportado a las bistiazolidinas (BTZs) como inhibidores en el rango μM de las tres subclases de MBLs. Estos compuestos imitan a las penicilinas; poseen dos anillos de 5 miembros, un tiol como grupo de anclaje al sitio metálico y un carboxilato, similar al presente en las penicilinas y carbapenemes. Durante una parte de este trabajo de tesis se diseñaron variantes de BTZs con el objetivo de evaluar la esencialidad y función del tiol y carboxilato. Adicionalmente se evaluaron diversas sustituciones que permitan aumentar la potencia inhibitoria. De todos los compuestos analizados, la inclusión de un anillo aromático a las BTZs fue la que conllevo el aumento más marcado en la potencia inhibitoria. Dicho inhibidor restauro la acción de los carbapenemes en E. coli recombinantes expresando NDM-1 y en Enterobacterales clínicas portando enzimas B1; no mostró toxicidad en células eucariotas. Posteriormente, se diseñó una estructura que simule al intermediario y producto de la hidrólisis de las penicilinas, las llamadas 2-mercaptometil-tiazolidinas (MMTZs). Son compuestos monocíclicos que portan un tiol para unión a los centros metálicos, un carboxilato, similar al que contienen las penicilinas y los carbapenemes y un átomo de nitrógeno y de azufre en el anillo de 5 miembros. Las seis MMTZs que se sintetizaron difieren en la presencia o no de un gem-dimetilo, que simula al presente en las penicilinas, y en su estereoquímica. Todos los inhibidores fueron activos, en el rango sub-μM contra preparaciones de las enzimas: NDM-1, VIM-2, IMP-1 (B1), Sfh-I (B2) y L1 (B3). Muestran modos de unión muy conservados, en las enzimas B1 están estabilizado por medio de una interacción S-π aromático con el residuo en la posición 87. En las subclases también B2 y B3 las interacciones S-π aromático contribuyen al modo de unión de las MMTZ. Aunque diferentes factores serían los responsables de establecer los similares modos de unión en los tres sitios activos estructuralmente diferentes. Los compuestos restauraron la actividad de los carbapenemes contra un panel de Enterobacterales clínicas portando MBLs B1 y E. coli recombinantes expresando enzimas B2 y B3; no mostraron toxicidad contra varias líneas celulares eucariotas. Finalmente, uno de los mecanismos evolutivos de las β-lactamasas fue estudiado. Luego de la introducción de cada una de las clases de antibióticos β-lactámicos en la clínica, las SBLs clase A se adaptaron a los nuevos blancos, otorgando a la bacteria resistencia a los mismos. Lo lograron mediante la incorporación de substituciones, generando nuevas variantes, o con la inclusión de nuevas familias de enzimas. Esto generó un variable rango de sustratos en la misma clase. Sin embargo, una característica que todas comparten es la dificultad de hidrolizar a la ceftazidima, una cefalosporina de tercera generación, dada su complejidad estructural y gran tamaño. Las variantes que han surgido usualmente adoptan sustituciones que amplían el tamaño del sitio activo y permiten unir e hidrolizar a la ceftazidima más eficientemente. Sin embargo, dentro de la familia de CTX-M, surge en la clínica una variante de CTX-M-14, CTX-M-16 que porta dos sustituciones en la misma hoja β. Ninguna de las dos está en el Ω-loop, uno de los sitios típicos que es tuneado para la expansión del sitio activo. Es más, se reportó previamente que las estructuras cristalografías de las enzimas libres son altamente superponibles siendo los sitios activos todos de igual tamaño. En esta tesis, mediante RMN, fue analizada la dinámica de la enzima salvaje, de CTX-M-16 y las dos simples mutantes, que también fueron identificadas en la clínica. Se observó que, en escalas de tiempo rápidas, todas las enzimas tienen una estructura rígida. Sin embargo, la doble mutante aumenta notablemente su flexibilidad, en escalas de tiempo lentas, en todos los bucles que rodean al sitio activo. Con lo que se propone que dicha enzima accede a un estado conformacional que adopte un sitio activo agrandado, lo cual le permita una tener mayor eficiencia catalítica frente a la ceftazidima. Posiblemente esta sea otra de las estrategias evolutivas de esta clase de enzimas que le permitiría adaptarse a nuevos blancos; toleran un aumento en la dinámica lenta, pero conservan la rigidez en movimientos rápidos.