Desarrollo de un cóctel de fagos para el biocontrol de virotipos de Escherichia coli en la industria alimenticia regional
| dc.contributor.advisor | Balagué, Claudia Elizabeth | |
| dc.contributor.coadvisor | Quiberoni, Andrea | |
| dc.creator | Tomat, David Damián | |
| dc.date.accessioned | 2017-12-19T18:15:09Z | |
| dc.date.available | 2017-12-19T18:15:09Z | |
| dc.date.issued | 2014-03-20 | |
| dc.description.abstract | Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) constituyen un importante problema de salud a nivel mundial. Las mismas son provocadas por el consumo de agua o alimentos contaminados con microorganismos o parásitos, o bien por las sustancias tóxicas que éstos producen. Durante la última década se realizó un notorio esfuerzo a nivel mundial para el desarrollo de biopreservadores alimentarios, aun así, la emergencia de bacterias patógenas causantes de ETAs evidencia la necesidad urgente de investigar nuevas fuentes de agentes bioactivos para enfrentar y controlar este problema. Numerosos estudios involucran a cepas de Escherichia coli patógenas como responsables de ETAs. Específicamente, en nuestra región resulta especialmente importante controlar la diseminación de cepas de Escherichia coli shigatoxigénicas (STEC), ya que Argentina tiene la mayor tasa mundial de Síndrome Urémico Hemolítico debido a la diseminación de cepas STEC O157:H7 y no-O157, un patógeno emergente que infecta a los humanos a través de la ingestión de carne u otros alimentos contaminados. Varios factores de patogenicidad, además de las toxinas, como la intimina presente en STEC y cepas enteropatógenas (EPEC), son considerados necesarios en el proceso de infección, convirtiendo a estos patógenos en peligrosos con respecto a la inocuidad alimentaria. Por otro lado, los conservantes alimentarios, en las concentraciones autorizadas, en general no matan a los microorganismos, sino que solamente evitan su proliferación, limitando su utilidad a materias primas de muy buena calidad. Lo antes mencionado, sumado al incremento en el número de antibióticos a los cuales son resistentes las bacterias, generan la necesidad de nuevos enfoques tanto para garantizar la calidad como para extender la vida útil de los alimentos. Los bacteriofagos son los enemigos naturales de las bacterias y presentan una alta especificidad para sus células hospedadoras. La naturaleza es una fuente inagotable de fagos que evolucionan constantemente por lo que pueden adaptarse in situ para reinfectar bacterias resistentes. Además, son fáciles de aislar y son consumidos cotidianamente ya que están presentes en los alimentos y el agua por lo que representan una alternativa ecológica. Otra de las características que presentan los bacteriofagos es que se auto-amplifican así como se auto-limitan puesto que en presencia de su bacteria hospedadora se replicarán y posteriormente infectarán otras cepas en crecimiento mostrando un comportamiento de auto-amplificación, por otro lado, en ausencia de células hospedadoras los fagos no se replicarán mostrando una auto-limitación. A pesar de lo antes mencionado, solo recientemente se están realizando un mayor número de investigaciones respecto de su utilidad como agentes de biocontrol para ser empleados en inocuidad alimentaria. En función de lo anteriormente descripto, este trabajo tuvo como objetivo principal desarrollar una metodología novedosa y económica para el biocontrol de cepas patógenas de Escherichia coli mediante bacteriofagos para ser utilizados como aditivos en lácteos y cárnicos o en su proceso de producción. En primera instancia se realizó el aislamiento de bacteriofagos de E. coli desde materia fecal humana, posteriormente se analizó la morfología mediante microscopía electrónica, se evaluó tanto la ausencia de genes de patogenicidad utilizando la técnica de PCR como su estabilidad durante el almacenamiento. En el presente trabajo se aislaron seis bacteriofagos que presentaron un carácter lítico solo frente a cepas patógenas de E. coli. Entre ellos, se seleccionaron 3 fagos, a saber DT1, DT5 (para STEC no-O157 ARG4827, no hospedadora de DT1) y DT6, para evaluar la actividad lítica en cepas patógenas de E. coli frente a distintas condiciones de temperatura, pH y concentración de cloruro de sodio. Respecto de las microscopías electrónicas, los fagos forman parte de la familia Myoviridae, presentando tamaños de cabeza y cola similares. Este dato fue corroborado en un trabajo de tesina, mediante estudios de secuenciación (Migliore, 2011). Los ensayos moleculares de PCR permitieron descartar la presencia de los genes de patogenicidad frecuentemente asociados a cepas de E. coli diarreogénicas como stx1, stx2, eaeA, LT1 y ST1 en los seis bacteriofagos evaluados. En cuanto a la estabilidad durante el almacenamiento a 4°C, los seis fagos presentaron una leve disminución en el título fágico durante el primer mes así como durante el segundo mes, obteniéndose la menor viabilidad para el fago DT1 y siendo ésta del 55% respecto de la inicial, es decir, una reducción en la viabilidad a lo sumo de 0,26 log UFP al segundo mes de almacenamiento. Al evaluar la actividad lítica en distintas condiciones fisicoquímicas se determinó que, tanto frente a concentraciones crecientes de cloruro de sodio como valores bajos de pH y de temperatura, la actividad lítica fue menor para todos los sistemas evaluados, siendo éstos más afectados por el pH bajo, luego por las bajas temperaturas y en menor medida por la mayor concentración de cloruro de sodio ensayada. Con respecto a la interacción de los fagos con sus cepas sensibles, se investigó el rango de hospedador para cada fago así como el tiempo y número de eclosión para los fagos DT1 y DT6. También se determinó la eficiencia de plaqueo (EOP) para los fagos DT1, DT5 y DT6 y, adicionalmente, se estudió la naturaleza de los receptores fágicos presentes en cepas patógenas de E. coli. Los rangos de hospedador más amplios se obtuvieron para los fagos DT3, DT4 y DT6. Estos fueron capaces de lisar 16, 15 y 16 cepas del cepario evaluado, eespectivamente. Por otro lado, los fagos DT1, DT2 y DT5lisaron solo 6, 7 y 7 de las 104 cepas evaluadas, respectivamente, mostrando un rango estrecho de hospedador. Cabe destacar que las cepas no patógenas de E. coli así como las cepas no-E. coli no se vieron afectadas por los fagos evaluados. Los bacteriofagos DT1 y DT6 presentaron el mismo tiempo de eclosión, siendo éste de 33 minutos, por otro lado, los números de eclosión fueron de 76 para DT1 y 59 para DT6. Cuando se determinó la EOP, el fago DT1 mostró valores cercanos y superiores al 20%, mientras que el DT5 presentó los menores valores. Contrariamente, el fago DT6 mostró los mayores valores de EOP, obteniéndose valores de hasta 97,6%, sin embargo, para este fago también se obtuvo uno de los menores valores observados, siendo del 10,7% en el sistema con la cepa enteropatógena. Los estudios realizados para identificar los receptores fágicos para DT1, DT5 y DT6 evidenciaron la naturaleza hidrocarbonada de éstos en todas las cepas patógenas de E. coli evaluadas puesto que solo se observó una disminución significativa en la adsorción luego del tratamiento con peryodato. Posteriormente se realizaron ensayos de challenge in vitro a distintas temperaturas frente a la cepa DH5α y a las cepas patógenas PEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Se evaluaron fagos individuales así como formando parte de un cóctel, además se comparó la eficacia de los tratamientos y se determinó la evolución del recuento fágico a través de los ensayos. Respecto del biocontrol ejercido por los fagos, éstos fueron más eficaces a la mayor temperatura evaluada (37°C), obteniéndose valores de biocontrol de hasta 6,38 log UFC, sin embargo, a la menor temperatura (4°C) en la mayoría de los casos se obtuvieron valores de reducción significativos de hasta 3,79 log UFC. La acción lítica de los fagos frente a la cepa DH5α fue similar respecto de las patógenas, presentando reducciones logarítmicas del mismo orden de magnitud con la excepción del mayor tiempo de muestreo (24 h) donde DH5α fue más afectada. Al comparar los tratamientos a 37°C, el cóctel de fagos resultó ser el más efectivo para reducir el número de células viables, solo en dos casos un fago individual fue significativamente más efectivo que el cóctel, además nunca se obtuvo la menor reducción de células viables en un sistema tratado con la mezcla fágica. Por otro lado, los tratamientos con los fagos individuales presentaron una eficacia variable independientemente del sistema evaluado. La evolución de los títulos fágicos varió a lo sumo en 1 log UFP/ml, en la mayoría de los casos aumentando levemente y permaneciendo siempre en un número elevado. Luego se realizaron ensayos de biocontrol con fagos sobre la matriz alimenticia.Se evaluaron tanto fagos individuales como cócteles sobre productos cárnicos contaminados artificialmente con DH5α y cepas patógenas, a saber EPEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Además, se evaluó el porcentaje de recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria. En general se observaron reducciones, si bien significativas, relativamente bajas cuando se utilizaron fagos individuales en los ensayos de biocontrol a ambas temperaturas evaluadas (5 y 24°C). Por otro lado, cuando se emplearon cócteles en los ensayos las reducciones significativas observadas fueron mayores. A modo de ejemplo, empleando una MOI del mismo orden de magnitud, la cepa STEC464 O157:H7 sufrió una reducción similar a las 3 h de incubación utilizando un fago individual o el cóctel, mientras que a las 6 h el cóctel produjo una reducción 1,6 log UFC mayor que el fago individual a 24°C evidenciando la utilidad del cóctel para prevenir un posterior recrecimiento bacteriano. Además, durante los experimentos la recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria osciló entre el 61,4% y el 85,4%. Durante los ensayos en cárnicos, en algunos casos se observó un recrecimiento bacteriano al mayor tiempo de muestreo (24 h), por lo que se planteó el aislamiento de mutantes insensibles a bacteriofagos (BIMs) desde los experimentos en carnes así como por la metodología de cultivo secundario. Una vez aislados, los BIMs fueron confirmados por el test de sensibilidad en medio líquido y se determinó la frecuencia de aislamiento para cada BIM confirmado. Además, se seleccionaron 9 BIMs confirmados, 5 obtenidos a partir del cultivo secundario y 4 a partir de los ensayos en carnes, y se evaluó la estabilidad y reversión. De los 16 BIMs aislados por la metodología de cultivo secundario se confirmaron como BIMs verdaderos el 75,0%, mientras que de los 30 BIMs aislados desde carnes se evaluaron 14 y solo se confirmaron como verdaderos el 28,5%. Además de presentar frecuencias de aislamiento bajas, oscilando entre 3,7x10-7 y 1,8x10-6, los BIMs presentaron una estabilidad variable y solo uno fue capaz de revertir el fenotipo de resistencia. Otra matriz alimentaria utilizada para los ensayos de biocontrol fueron los lácteos. En los ensayos realizados durante un proceso de fermentación láctica, en el 67% de los casos el tratamiento fágico eliminó completamente la cepa bacteriana inoculada, además, cuando se utilizó el cóctel, este eliminó el patógeno en un menor tiempo respecto de los fagos individuales. Por otro lado, en ensayos realizados durante un proceso de cuajado, si bien se inactivó rápida y completamente el 50% de las cepas evaluadas, no se observó la eficacia obtenida durante la fermentación para la cepa patógena STEC O157:H7 usando el cóctel a una MOI similar, sin embargo, éste pudo eliminar la cepa DH5α. Respecto de la estabilidad fágica, éstos presentaron un alto nivel de estabilidad en este tipo de matrices considerando los bajos valores de pH alcanzados. Por otro lado, tanto los cultivos iniciadores, a saber Streptococcus thermophilus, como la evolución general de los parámetros del proceso de fermentación láctica como del proceso de cuajado, no se vieron afectados por la adición exógena de bacteriofagos. Finalmente, se evaluó la eficacia del tratamiento con cócteles fágicos sobre superficies sólidas, específicamente sobre cubreobjetos de vidrio (CV) y acero inoxidable (AI), emulando superficies inanimadas potencialmente contaminadas que se pueden encontrar tanto en un ambiente industrial como en el hogar. En los ensayos realizados en CV se obtuvo una eliminación completa de los patógenos EPEC920 y STEC464 O157:H7 tanto a 5 como a 37°C, observándose un recrecimiento de ~1,5 log UFC para esta última cepa a alto inóculo bacteriano. Contrariamente, la cepa STEC no-O157 ARG4827, si bien se vio reducida en su número inicialmente, no se logró eliminar a 5°C y presentó un recrecimiento posterior a 37°C. Cuando se evaluaron los resultados obtenidos en la matriz AI, se determinó que el cóctel fue capaz de eliminar completamente todas las cepas evaluadas a 5°C y a STEC no-O157 ARG4827 a 37°C, mientras que STEC464 O157:H7 y EPEC920 presentaron un recrecimiento posterior a alto, y a bajo y alto inóculo bacteriano, respectivamente. Cabe destacar que se ha logrado una gran especificidad de acción sobre cepas patógenas de E. coli y que estudios posteriores permitirán desarrollar cocteles fágicos con mayores eficiencias de reducción bacteriana. Los mejores resultados se obtuvieron en los ensayos de biocontrol sobre superficies sólidas, a saber cubreobjetos de vidrio y acero inoxidable, y durante los procesos de fermentación láctica y cuajado. También se observaron reducciones bacterianas significativas en la matriz cárnica. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis sugieren, en primera instancia, que los bacteriofagos aislados en nuestro laboratorio son útiles para el biocontrol de cepas patógenas de E. coli en alimentos. | es |
| dc.description.fil | Fil: Tomat, David Damián. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina | es |
| dc.format | application/pdf | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/2133/10313 | |
| dc.language.iso | spa | es |
| dc.publisher | Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. | es |
| dc.rights | openAccess | es |
| dc.rights.holder | Tomat, David Damián | es |
| dc.rights.text | Atribución – No Comercial – Compartir Igual (by-nc-sa): No se permite un uso comercial de la obra original ni de las posibles obras derivadas, la distribución de las cuales se debe hacer con una licencia igual a la que regula la obra original. https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/ | es |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/ | * |
| dc.subject | Bacteriófago | es |
| dc.subject | Escherichia coli | es |
| dc.subject | Alimentos | es |
| dc.title | Desarrollo de un cóctel de fagos para el biocontrol de virotipos de Escherichia coli en la industria alimenticia regional | es |
| dc.type | doctoralThesis | |
| dc.type | Tésis de Doctorado | |
| dc.type | acceptedVersion | |
| dc.type.collection | tesis | |
| dc.type.other | doctoralThesis | es |
| dc.type.version | acceptedVersion | es |
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