Caracterización de frataxinas de algas y plantas

Los centros Fe-S son cofactores de proteínas centrales en procesos fundamentales para la vida, incluyendo la fotosíntesis, fijación de nitrógeno y respiración celular. La biosíntesis de estas moléculas requiere de un proceso controlado debido a que, en sus formas libres, los iones Fe+2 y S-2 son tóxicos para la célula. En organismos eucariotas y procariotas existen varios complejos proteicos encargados de la biosíntesis de los grupos Fe-S en diferentes situaciones fisiológicas denominados sistemas NIF, SUF, ISC y CIA. El mecanismo básico para el ensamblado de los grupos Fe-S en todos estos sistemas se puede dividir en dos etapas: la unión del hierro y el azufre a una proteína molde y la transferencia del centro Fe-S a las apoproteínas blanco mediado por chaperonas con especificidad variable. A partir de estudios en células de mamíferos y levaduras, se postuló la participación de frataxina en el ensamblado de centros Fe-S, como también en el metabolismo energético mitocondrial, respiración y homeostasis del hierro. Frataxina es una proteína mitocondrial y está altamente conservada desde bacterias hasta mamíferos y plantas, sin presentar mayores cambios estructurales. Esto sugiere que esta proteína cumpliría funciones similares en todos estos organismos. Las plantas poseen tres sistemas que conducen a la formación de grupos Fe-S: el sistema ISC en mitocondrias, la maquinaria SUF en cloroplastos y el sistema CIA en el citosol. Debido a esta compartimentación, y a que las proteínas involucradas se encuentran principalmente codificadas en el núcleo, la regulación y la comunicación en y entre los tres sistemas parecen ser complejas y en su gran mayoría desconocidas. Estudios previos realizados en el laboratorio demostraron que en Arabidopsis thaliana el homólogo de frataxina, AtFH, es una proteína esencial de localización mitocondrial y cloroplástica. Distintas líneas de Arabidopsis con niveles reducidos de esta proteína (antisense y knock-down) presentaron un retardo en el desarrollo, alto contenido de hierro mitocondrial, aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, menor contenido de hemo total y disminución en la actividad de hemoproteínas y de proteínas mitocondriales con centros Fe-S. Así, a partir de estos resultados se propuso que AtFH tendría un rol importante en las mitocondrias de las plantas, participando en el almacenamiento del Fe biodisponible, en la respuesta al estrés oxidativo y en la formación de los grupos hemo y de centros Fe-S. En este trabajo, se generaron plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas mediante la técnica de floral dip que sobreexpresan AtFH y se las caracterizó fenotípicamente creciéndolas en medio MS, obteniéndose plantas con mayor área de roseta, longitud de raíz principal y raíces laterales, número de semillas por vaina y relación peso fresco/peso seco (PF/PS). A partir de estos resultados, se decidió estudiar cómo se modifica el fenotipo de estas líneas al crecerlas en medios con distintas concentraciones de Fe (en condiciones de deficiencia, suficiencia y exceso de Fe), y compararlas con la línea Col-0 y las líneas antisense (previamente estudiadas en el laboratorio), observándose un mejor crecimiento de las líneas sobreexpresantes en todas las condiciones. Además, se determinó el contenido de Fe, en hojas y raíces, mediante tinción de Perls y espectrometría de masas de plasma acoplado por inducción (ICP-MS). Las líneas sobreexpresantes presentaron una mayor cantidad de Fe en raíces en condiciones de deficiencia del metal, lo que explica el mejor desarrollo de esta línea en esta condición. Por otro lado, para las condiciones de suficiencia y exceso de Fe, estas líneas presentaron un mayor contenido de Fe en hojas, por lo que se propone como hipótesis que esta cantidad extra de Fe no sería tóxica para las células ya que podría estar unido a AtFH, actuando esta última como una proteína de almacenamiento, permitiendo un correcto desarrollo de la planta. Posteriormente, se midió mediante qPCR la expresión de genes de la vía de síntesis de centros Fe-S. Los resultados mostraron una inducción en los niveles de ARNm de la cisteína desulfurasa mitocondrial (AtNSF1) y AtISD11, una proteína regulatoria que formaría parte del complejo ISC mitocondrial de síntesis de grupos Fe-S. Esto coincide con resultados previos obtenidos en el laboratorio en los que se estudiaron líneas AtNFS1 sobreexpresantes, observándose una inducción en la expresión de los genes AtFH y AtISD11. Además, los estudios a nivel de proteína revelaron que AtISD11 y AtFH estarían actuando como reguladores de AtNFS1, incrementando la actividad desulfurasa y sugiriendo que estas tres proteínas podrían interactuar formando un complejo multiproteico. Todo lo mencionado anteriormente indica que estos genes podrían tener elementos de control génico en común, proponiéndose entonces como hipótesis que la transcripción de los genes AtFH, AtISD11 y AtNFS1 se encontraría coordinada. Por último, se estudió mediante qPCR la expresión de los genes involucrados en el transporte de Fe en raíces de las líneas sobreexpresantes, encontrándose un incremento en los transcriptos del transportador IRT1, del regulador FIT, y de la enzima ferroquelatoreductasa2 (FRO2). Adicionalmente, la actividad ferroquelatoreductasa se vio incrementada en estas líneas. Estos resultados indicarían que la maquinaria de captación de Fe en estas plantas se encontraría activada al crecerlas en condiciones de suficiencia de Fe, y que estas líneas se comportarían como las plantas wild type crecidas en deficiencia de Fe, incorporando continuamente dicho elemento en las raíces, el cual es transportado y acumulado en hojas. A partir de estos resultados podemos proponer que las plantas AtFH sobreexpresantes sensarían continuamente una deficiencia de Fe. En la última parte del trabajo de Tesis, se identificó y caracterizó CrFH, el homólogo de frataxina proveniente de Chlamydomonas reinhardtii. El gen de frataxina no ha sido descripto en algas al presente. C. reinhardtii se ha usado en los últimos años como un excelente sistema experimental para estudiar el metabolismo del hierro. Así, esta alga constituye un buen modelo de estudio ya que posee un genoma compacto, es fácil de crecer en el laboratorio y puede ser modificada genéticamente por medio de recombinación homóloga eficiente. Para realizar los estudios in vitro, CrFH fue clonada, expresada y purificada. Su masa molecular y estado de oligomerización fueron determinados usando electroforesis en condiciones nativas. Los resultados obtenidos indican que CrFH forma dímeros en presencia de Fe, Zn y Cu. Además, el agregado de CrFH a una mezcla conteniendo Fe2+ y H2O2 resulto en una atenuación significativa de la reacción de Fenton. Asimismo, las bacterias que expresan CrFH crecieron mejor en medios LB suplementados con altas concentraciones de metales (Cu, Cd, Fe, Zn, Ni, As) y también luego de incubarlos con H2O2 20 mM. Estos resultados indican que CrFH es una proteína esencial en C. reinhardtii, involucrada en la homeostasis del Fe, la protección del daño oxidativo y la mantención del estado celular redox. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen a comprender mejor las propiedades estructurales y funcionales de los homólogos a frataxina en plantas y algas.