Control de la proliferación y diferenciación celular en plantas por microARNs

El tamaño final de los órganos está determinado mayormente por la extensión de una fase inicial de proliferación celular, seguida de una fase de expansión y diferenciación celular. El control de estos procesos involucra la acción concertada de varias vías de señalización hormonal y de redes de factores de transcripción, los cuales pueden, a su vez, ser regulados por miARNs. Los microARNs (miARNs) son ARN pequeños de 20-21 nucleótidos y constituyen un sistema ampliamente distribuido para controlar la expresión génica. El miARN miR396 regula los factores de transcripción de la familia GROWTH REGULATING FACTORs (GRFs). Estos factores de transcripción se caracterizan por presentar dos dominios conservados llamados WRC y QLQ, que median la unión al ADN y la interacción con otras proteínas, respectivamente. En Arabidopsis thaliana, siete de los nueve GRFs son regulados por miR396. A su vez, los GRFs forman complejos con los GRF-INTERACTING FACTORS (GIFs). El sistema miR396/GRFs se encuentra conservado en angiospermas y gimnospermas. Los GRFs estimulan la proliferación celular, mientras que la represión de los mismos por el miARN miR396 detiene la división celular y dispara la diferenciación. Durante el desarrollo de la hoja este sistema regulatorio tiene un rol fundamental en la determinación el tamaño y forma del órgano, así como también participa en el control de la senescencia. En este trabajo de tesis, en primer lugar, se analizó el control del balance miR396/GRFs como potencial herramienta biotecnológica. Obtuvimos plantas con hojas más grandes a través de la reducción de la actividad de miR396. Demostramos que versiones resistentes a la regulación de miR396 de los genes de Arabidopsis thaliana AtGRF2 (rGRF2) y AtGRF3 (rGRF3) aumentan el tamaño de las hojas, pero que rGRF3 resulta ser más eficiente. La introducción de At-rGRF3 en Brassica oleracea produce aumento de hojas, raíz y semillas. Además, cuando genes homólogos At-rGRF3 de soja y arroz son introducidos en Arabidopsis, también se incrementa el tamaño de la hoja. Esto sugiere que la regulación de miR396 sobre GRF3 es importante para el control del crecimiento de los órganos en un amplio rango de especies. Las plantas que expresan rGRF3 presentaron hojas más grandes que las silvestres, incluso en condiciones de estrés por sequía, estado en el cual se estimula la expresión de miR396. Por otro lado, se analizó la evolución de la regulación de miR396 sobre los GRFs y se encontró que la relación se encuentra ampliamente conservada evolutivamente. En la mayoría de las especies de dicotiledóneas todos los genes GRF están regulados por miR396. Sin embargo, observamos que dentro de las Brasicáceas existe un subgrupo de genes GRFs que han perdido dicha regulación. En Arabidopsis thaliana, estos genes son GRF5 y GRF6. Posiblemente, el subgrupo de GRFs no regulados por miR396 provenga de un único ancestro común que perdió originalmente la regulación. Estudios sobre AtGRF5 muestran que presenta funciones redundantes con los GRFs involucrados en el control del tamaño de la hoja y regulados por miR396. Análisis del promotor de GRF5 mostraron secuencias altamente conservadas en las Brasicáceas. En particular, la eliminación de uno de estos motivos conservados causa la expresión ectópica de GRF5. Estos resultado sugieren que la expresión de GRF5 se controla por represión transcripcional, en contraste con los otros GRFs reprimidos post-transcripcionalmente por miR396. A partir del análisis de distintos candidatos, identificamos que el represor transcripcional es el factor de transcripción AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2). Mutantes por perdida de función de arf2 presentan efectos fenotípicos pleiotrópicos, incluyendo hojas más grandes, que se asemejan a los observados en plantas que sobreexpresan GRF5. Un análisis de mutantes arf2 reveló que presentan incremento de los niveles de expresión de GRF5 y otros GRFs. Finalmente, a través de análisis genéticos y moleculares describimos como ARF2 controla la proliferación celular en hojas a través de GRF5. En forma más general, describimos una red regulatoria donde se vincula a ARF2 con el sistema de miR396/GRFs/GIFs en el control de la proliferación celular durante el desarrollo de las hojas.