Regulación de la biogénesis de miARNs en Arabidopsis thaliana

Los microARNs (miARNs) son ARNs no codificantes pequeños de entre 20 y 22 nucleótidos que regulan post-transcripcionalmente otros ARNs. La biogénesis de los microARNs comprende la transcripción de un locus endógeno, su procesamiento para dar lugar al microARN maduro y finalmente su asociación con ARGONAUTA para cumplir su función regulatoria. Los precursores de miARN de plantas son diversos en tamaño y forma, y en consecuencia pueden procesarse por diversos mecanismos. A pesar de ello, la mayoría de los precursores contienen un segmento de ARNdh de 15-17 pb entre una región de ARN simple hebra y el sitio donde ocurre el primer corte. Los miARN también están presentes en animales, donde se ha descripto que sus precursores presentan pequeños motivos de secuencia que modulan la eficiencia y precisión con la que son procesados. No se ha estudiado la presencia de este tipo de elementos regulatorios en los precursores de plantas. En esta Tesis se estudió la importancia de secuencia primaria para la biogénesis de los microARNs de plantas. Primeramente, se investigó la identidad de bases a lo largo de los precursores, y en particular en los sitios de corte por DCL1. Encontramos que la región más estructurada de los precursores está formada por aproximadamente un 70% de pares canónicos de Watson-Crick (G-C y A-U), mientras que las combinaciones de bases desapareadas (mismatches) ocurren con diferentes frecuencias. Encontramos que la región cortada por DCL1 presenta una arquitectura particular no solo a nivel de estructura sino a nivel de las bases que lo forman. Estudiamos el efecto de la identidad de las bases durante el procesamiento de miARNs in vivo. En particular encontramos que los mismatches más frecuentes en las estructuras de los precursores son del tipo U-U, A-C y U-C, mientras que otros mismatches se encuentran en baja frecuencia como los C-C y G-G. Un análisis experimental sistemático revelo que los mismatches C-C disminuyen el procesamiento de precursores de miARNs. Este efecto estaría mediado por aumento de flexibilidad en la estructura del precursor ocasionada por el mismatch C-C en particular, la cual termina afectando el procesamiento por DCL1. Luego, estudiamos el precursor del miR172a. Este miARN es importante en la determinación del tiempo de floración y establecimiento del patrón de la flor. Nos enfocamos en las características particulares de este miARN, en busca de información relevante para su biogénesis o actividad. Encontramos que el grado de apareamiento del tallo inferior y del dúplex de miARN/miARN* puede modular su biogénesis. En particular un alto grado de apareamiento del dúplex favorece su procesamiento. Esta característica la observamos también en otros precursores, como el MIR172C, MIR171B y MIR164A. Estos precursores presentan cierto número de mismatches entre el miARN y miARN*, y al cerrarlos la biogénesis de cada miARN aumentó. Por otro lado, el precursor del miR166b presenta un dúplex muy desapareado, y para este miARN en particular, describimos que esta característica es necesaria para su biogénesis, siendo un precursor no-canónico. Finalmente, nuestros experimentos mostraron que un aumento en la acumulación de miARN, no necesariamente implica una mayor actividad. En ese sentido, la asociación de un miARN con una ARGONAUTA es un proceso crucial. El miR172a es un miARN particularmente interesante en este aspecto, ya que presenta un nucleótido 5’ Adenina. Este nucléotido es poco frecuente en el 5’ de los miARNs, siendo Uracilo el más común. Encontramos que la identidad de dicho nucleótido y la presencia de AGO2 son necesarios para la máxima actividad del miR172a.