Desarrollo de nuevos agentes antiinfecciosos a partir de diaminas alifáticas

Las enfermedades infecciosas son causadas por agentes etiológicos muy diversos, incluyendo parásitos, bacterias, hongos y virus. Dentro de estas patologías se encuentran las enfermedades tropicales desatendidas, que afectan a más de 1.000 millones de personas en todo el mundo, e impactan principalmente a los sectores más vulnerables de la población. Esta clasificación incluye más de 20 enfermedades, o grupos de enfermedades, incluyendo la enfermedad de Chagas, las leishmaniasis y la tripanosomiasis humana africana. Otras enfermedades infecciosas que afectan gravemente a la salud pública a nivel global son la tuberculosis y la malaria. Estas enfermedades continúan siendo unas de las principales causas de muertes por enfermedades infecciosas a nivel global, con el agravante que produce la generación de cepas resistentes. Si bien históricamente eran consideradas como enfermedades desatendidas, el aumento de la inversión en investigación en la última década las ha sacado de esa categoría. Los tratamientos disponibles para las enfermedades tropicales desatendidas, la tuberculosis y la malaria poseen numerosos inconvenientes. Algunos de ellos son: problemas de toxicidad, administración, generación de cepas resistentes, entre otros. Por lo tanto, es primordial el desarrollo de nuevos fármacos para la implementación de tratamientos superadores. En trabajos realizados previamente en nuestro grupo se sintetizó una colección de cerca de 90 diaminas alifáticas N,N´-disustituidas, las cuales demostraron potentes actividades frente a parásitos tripanosomátidos y apicomplejos. Numerosos compuestos exhibieron potentes actividades frente a todos los parásitos analizados, siendo potenciales agentes quimioterapéuticos de amplio espectro. Por otro lado, debido a que la estrategia de búsqueda de hits comenzó con ensayos fenotípicos sobre los distintos parásitos, no se disponía de información de los mecanismos de acción en cada uno de los patógenos. El presente trabajo de Tesis tuvo como objetivo el desarrollo de agentes antiinfecciosos a partir de las diaminas N,N´-disustituidas. Con este objetivo, se analizó la selectividad de una selección de miembros de la biblioteca determinando la actividad antimicrobiana y fungicida, con especial énfasis en la actividad antimicobacteriana. De los compuestos estudiados, el derivado N 1 ,N3 -bis(4- (benciloxi)bencil)propano-1,3-diamina resultó el mejor candidato con una actividad de 3 µM en M. tuberculosis en medio sólido. Este compuesto exhibe actividad antimicobacteriana y antiparasitaria de amplio espectro, siendo activo frente a tripanosomátidos, apicoplastos, micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. Es de destacar que no presentó actividad significativa frente a bacterias Gram positivas, Gram negativas ni hongos patógenos. Por otro lado, se expandió el estudio de la actividad frente a Leishmania, ya que esta enfermedad es generada por una gran variedad de especies y produce diferentes manifestaciones clínicas. Debido a que disponíamos los resultados de actividad en L. donovani, se expandió el estudio de una selección de nueve análogos representativos frente L. amazonensis y L. braziliensis, variantes que producen leishmaniasis cutánea en Sudamérica y la otra especie responsable de leishmaniasis visceral, L. infantum. Los resultados obtenidos mostraron que los derivados seleccionados presentaron actividades por debajo de 1 µM, tanto en el estadio promastigote, como en amastigotes. Con el fin de investigar el mecanismo de acción de las diaminas N,N´-disustituidas se utilizaron diferentes enfoques para inferir posibles blancos biológicos. Por un lado, se realizaron estudios experimentales tendientes a validar si el trasporte de poliaminas y la vía glicolítica estaban involucradas en el mecanismo de acción. Estos estudios fueron realizados en epimastigotes de T. cruzi, examinando la inhibición del transporte de putrescina y la variación de los metabolitos excretados al medio de cultivo por resonancia magnética nuclear de protones. La inhibición del transporte de putrescina de las diaminas N,N´-di seleccionadas fue muy variada, con un rango de inhibición del 10 al 86% a una concentración de 25 µM. Comparando los resultados de inhibición enzimática y la inhibición del crecimiento parasitario no se observa una clara correlación entre la actividad y la longitud de la cadena alifática y el sustituyente del anillo aromático. El derivado 3c, fue el compuesto que mayor inhibición presentó, con un IC50 de inhibición del transporte de 3,79 µM; por lo que este blanco tendría un rol protagónico en el mecanismo de acción. Se abordó un estudio de metabolómica dirigida determinando la concentración de acetato, lactato, piruvato, alanina y succinato excretados al medio usando RMN 1H. En experimentos con una selección de derivados y posteriormente con el compuesto 3c, usando cultivos de epimastigotes de T. cruzi de la cepa Dm28c, se encontró que no existiría interferencia en la vía glicolítica. Esta conclusión se fundamenta en que la disminución en la concentración de los metabolitos se correlaciona con la cantidad de parásitos al final del ensayo. En efecto, en los experimentos usando 3c una concentración de 0,49 M (0.10 IC50), la concentración parasitaria fue del 67% respecto al control y la disminución de la concentración de los metabolitos fue en general, menor a ese porcentaje. Adicionalmente, se realizaron estudios in silico para predecir posibles blancos de acción (in silico target fishing). Recurriendo a la plataforma TDRtargets se determinaron posibles blancos en los agentes etiológicos de las enfermedades en estudio y se recurrió a otras plataformas para determinar posibles blancos de acción en los seres humanos que podría provocar problemas de citotoxicidad. Como resultado de estos estudios se encontró que las enzimas acil-CoA sintetasas, que participan del catabolismo de lípidos, serían el principal blanco potencial. Con el fin de expandir el estudio de relación estructura actividad y de abordar aproximaciones de simplificación molecular, se sintetizaron 17 nuevos análogos. Estos compuestos pertenecen a tres quimiotipos diferentes: monoaminas, diaminas monosustituidas, y diaminoalcoholes. Estos nuevos derivados fueron testeados en epimastigotes de T. cruzi, exhibiendo 6 de ellos IC50 menores de 10 µM. Sin embargo, los nuevos análogos no presentaron actividades superiores a las diaminas N,N´- disustituidas, aunque potencialmente pueden presentar mejores parámetros fisicoquímicos, específicamente solubilidad acuosa. Finalmente, y con la idea de implementar estudios de internalización y metabolización por RMN de 19F, se sintetizaron 14 derivados fluorados pertenecientes a los quimiotipos N,N´-disustituidas, monoaminas y diaminas monosustituidas. Analizamos las actividades a concentraciones fijas a 10, 50 y 100 µM. De los análogos sintetizados, 5 presentaron actividades menores de 10 µM, pertenecientes a las series m y c5F, miméticos fluorados e las series a y c. Adicionalmente, realizamos ensayos para determinar los límites de detección de los respectivos núcleos fluorados en CDCl3 en RMN de 19F desacoplado y con 128 acumulaciones, siendo de 200 µM para el flúor único a anillos aromáticos y de 100 µM para el flúor alifático. Por último, realizamos experimentos de internalización seleccionando compuestos con actividad potente, moderada y no activos. Sin embargo, no detectamos en ninguno de los extractos obtenidos la presencia de flúor. Por lo que será necesario la optimización del método utilizado.