Participación de las proteínas del sistema de secreción tipo III de Xanthomonas axonopodis pv. citri, Hpa1 y HrpE, en la interacción planta patógeno

La Cancrosis de los Cítricos es considerada en la actualidad una de las enfermedades más peligrosas y perjudiciales para la citricultura en Argentina y en el mundo, debido a los daños causados en la producción y calidad de los frutos, siendo Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) la bacteria fitopatógena responsable de esta enfermedad. Las bacterias fitopatógenas colonizan a sus hospedadores a través de la secreción de proteínas mediante el Sistema de Secreción de Tipo III (SST3). Este sistema está codificado por el cluster hrp, el cual es esencial para la patogenicidad en plantas hospedadoras y la inducción de HR en plantas no hospedadoras. El cluster hrp de Xac contiene un gen que codifica para una proteína harpin llamada Hpa1. Las harpin son proteínas estables al calor, ricas en glicina, que pueden formar poros en membranas, inducir HR en algunas plantas y formar estructuras fibrilares. Con el objetivo de estudiar la función de la proteína Hpa1 de Xac en la patogenicidad, se expresó y se purificó esta proteína en forma recombinante, y se generó la cepa mutante de Xac en el gen hpa1. A través de diversos estudios analizando los fenotipos generados tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, la expresión de sus genes en respuesta a la Hpa1, y los efectos que produce esta proteína sobre las células bacterianas, se logró determinar que la misma posee un rol dual en la patogenicidad de Xac, por un lado promoviendo la inducción de la respuesta de defensa basal de las plantas, y por otro aumentando la virulencia del patógeno, probablemente causando cambios en la estructura del mesófilo de las hojas de cítricos y promoviendo la agregación de las células bacterianas. A su vez, se realizaron estudios utilizando técnicas biofísicas con la intención de comprender el funcionamiento de esta proteína, al mismo tiempo que se estudiaron dos dominios de la misma con el objetivo de caracterizar sus roles dentro de la proteína. Esto permitió estudiar la relación estructura-función de Hpa1 con mayor detalle. Se determinó que ambos dominios inducen HR en tejidos de plantas no hospedadoras, mientras que la capacidad de formación de fibras y de agregar células bacterianas es particular y propia de la región amino terminal de la proteína. Por otro lado, el gen hrpE perteneciente también al cluster hrp de Xac codifica para la proteína pilina que constituye el Pilus Hrp del SST3. Se estudiaron nuevos roles para esta proteína, determinando los efectos que produce la misma en las plantas. Así se logró determinar que HrpE es reconocida tanto por plantas hospedadoras como no hospedadoras. En el caso de las plantas no hospedadoras, las mismas respondieron desarrollando HR, deposición de calosa y producción de ROS, y un aumento en la expresión de genes relacionados con respuestas de defensa, mientras que en naranja todas esta respuestas fueron significativamente más leves en intensidad. Además, fue encontrada una nueva función para esta pilina promoviendo el priming tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, disminuyendo el grado de infección de Xac y del fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), causante de la enfermedad Mancha o Sarna Bacteriana en plantas de tomate y pimiento. Al mismo tiempo se analizó la factibilidad del uso de anticuerpos contra esta pilina, como estrategia para la obtención de plantas resistentes a la Cancrosis de los Cítricos. De esta forma, se encontró una significativa disminución de los efectos producidos tanto por HrpE recombinante como por Xac y Xcv en plantas de naranja, validando esta estrategia para el futuro desarrollo de plantas resistentes que expresen transgénicamente estos anticuerpos. Las proteínas blanco de naranja encontradas a través del ensayo de doble híbrido en levaduras para HrpE y Hpa1, mostraron una diversa variedad de funciones, entre ellas, se encontraron proteínas cuyos genes se ven inducidos, o forman parte de la defensa, frente a algún estrés tanto biótico como abiótico; proteínas pertenecientes a los mecanismos de degradación de otras proteínas; enzimas involucradas en el metabolismo, ya sea primario o secundario; proteínas relacionadas al ciclo celular; enzimas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis redox de la célula; proteínas de membrana tanto quinasas sensoras como transportadores de iones o azucares; enzimas involucradas en la producción de fitohormonas; y proteínas relacionadas con el reordenamiento y la muerte celular.