Investigación de la interacción calcio-fosfatasa alcalina intestinal de rata y su relación con la absorción intestinal de calcio

El monofluorfosfato de sodio es utilizado con fines terapéuticos en pacientes con osteoporosis. Habitualmente dicha medicación es acompañada con la administración de sales de calcio (Ca2+). Luego de una dosis oral de monofluorfosfato de sodio una fracción es absorbida en el estómago mientras que en la luz intestinal el remanente es absorbido como fluoruro luego de la hidrólisis por la fosfatasa alcalina intestinal (FAi). Experimentos previos demostraron que el Ca2+ en concentración 50 mM inhibe no competitivamente la FAi de rata. La FAi tiene máxima expresión en duodeno y si bien no tiene aún un rol definido a nivel intestinal es llamativo que: 1) Su expresión es regulada por la calcitriol al igual que las proteínas que participan en la absorción de Ca2+. 2) La distribución del transportador TRPV6 tiene el mismo patrón que la FAi. 3) La FAi se expresa a nivel intestinal coincidiendo con el sitio de mayor absorción del catión. 4) La distribución de los dos mecanismos de transporte de Ca2+ (activo y pasivo) en intestino delgado sea similar a la distribución de las dos isoformas de FAi. El objetivo de este proyecto de tesis fue estudiar la interacción entre el Ca2+ y la FAi y el efecto de dicha interacción sobre el proceso de absorción del catión. Para cumplir con los objetivos se purificó FAi a partir del duodeno de ratas adultas y se produjo un anticuerpo por su inoculación a cobayos. Con la FAi purificada se hallaron los parámetros de fijación de Ca2+ a la FAi. Los resultados hallados indican que el Ca2+ se une a la FAi siguiendo un modelo de “n” sitios independendientes e igual afinidad. La constante de afinidad fue 19.1±8.4 mM-1 con 7.8±4.4 sitio de unión. El efecto del Ca2+ sobre la actividad de FAi se investigó espectrofotométricamente (1) y por electroforesis (2). En ambos casos la actividad de FAi mostró un efecto bifásico dependiendo de la concentración de Ca2+. A concentraciones de Ca2+ menores a 10 mM la actividad se incrementó linealmente, mientras que con concentraciones de Ca2+ mayores a 20 mM la relación fue inversa [ 1) r = 0.946; r = -0.703; (2) r = 0.721; r = -0.773] Se investigaron los cambios estructurales de la FAi purificada de rata producidos por incubación de la enzima con Ca2+ 50 mM por cromatografía de exclusión molecular y Western blot. Se detectaron dos fracciones de la enzima: 168±6 kDa (con actividad enzimática) y 425±45 kDa (sin actividad nzimática). El punto isoeléctrico de la enzima resultó más alto en la presencia de Ca2+ (0 mM = 4.35±0.02; 50 mM = 4.85±0.06) , pero fue el mismo para la enzima y la forma agregada. El tratamiento con EGTA después de la adición de Ca2+ no restauró la actividad enzimática, pero produjo desagregació de la enzima y aparición de sus monómeros, indicando que el Ca2+ podría ser requerido para la acción de la enzima o estar involucrado en la estabilidad de la estructura dimérica. Empleando el modelo de intestino aislado in situ y determinación histoquímica se determinó el efecto de las diferentes concentraciones de Ca2+ in vivo sobre la actividad de la FAi. No se observó el efecto bisfásico hallado in vitro, sino se observó un aumento significativo de la actividad de la enzima en la membrana a medida que se incrementó la concentración de Ca2+. Los resultados de expresión de FAi en la membrana no mostraron diferencias significativas entre los grupos afirmando que las diferencias de la actividad observadas por histoquímica no se deben a un cambio de expresión Estos datos sumados a que la FAi modifica su expresión de acuerdo a los niveles de calcitriol hacen sospechar que podría actuar en el mecanismo de absorción de Ca2+. La FAi hidroliza éster monofosfóricos generando fosfato y protones y existe evidencia de que la disminución del pH del lumen intestinal modificaría la actividad de los canales de Ca2+ TRPV6. Se realizaron experimentos de sacos duodenales evertidos a fin de determinar el pH y la absorción de Ca2+ en función de diferentes concentraciones de Ca2+ luminal (1, 10, 50 y 100 mM). Se observó un descenso significativo del pH en solución mucosa de los grupos con 10, 50 y 100 mM. La fracción de absorción disminuyó a medida que se incrementó la concentración de Ca2+, aralelamente al descenso de pH. Los experimentos indican que el fosfato generado por hidrólisis no sería el responsable de la disminución de la fracción de absorción. Finalmente cuando los experimentos de sacos evertidos duodenales fueron llevados a cabos en presencia de L-fenilalanina se observó un descenso de pH significativamente menor con un incremento en la fracción de absorción en todos los grupos experimentales. Estos resultados fortalecerían la hipótesis que el pH regularía la entrada de Ca2+ por vía transcelular y la FAi sería sensora de las concentraciones de Ca2+ luminal e impediría el ingreso de cantidades tóxicas del catión al enterocito.