Estudio y caracterización de la capacidad de adsorción de nuevos lechos poliméricos con elevada capacidad de interacción con enzimas de interés biotecnológico e industrial
Fecha
2021
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Resumen
Las enzimas son piezas claves en la mayoría de los procesos
industriales y biotecnológicos de la actualidad. La preferencia de las mismas
como catalizadores en un gran número de procesos se debe a su elevada
especificidad, velocidad de reacción y a la posibilidad de ser reutilizadas en
varios ciclos catalíticos. El principal problema que plantea la utilización de
enzimas a gran escala es el elevado costo de las mismas en el mercado. Si se
tiene en cuenta que el proceso de purificación y concentración de una molécula
puede llegar a representar hasta el 80% del costo final de la misma, la
disminución de costos y tiempo para dicho proceso es un factor de importancia
fundamental a la hora de desarrollar nuevos protocolos.
Existen diversas metodologías disponibles para realizar bioseparación
de proteínas, pero sólo algunas permiten su aplicación en macroescala.
Además, los métodos de escalado clásicos para la purificación de enzimas,
como los que emplean precipitación con sales o solventes y los diferentes tipos
de cromatografías, producen residuos que causan un impacto negativo en el
ambiente y son difíciles de reciclar, incrementado los costos del proceso. En
este sentido, la adsorción es una de las operaciones unitarias más utilizadas en
la recuperación de macromoléculas. El principal problema de esta técnica es el
elevado costo de los adsorbentes comerciales y su corta vida útil, lo que ha
llevado a la necesidad de desarrollar nuevos lechos más económicos y con alta
capacidad de adsorción. El uso de polielectrolitos naturales para obtener matrices con capacidad
de adsorber proteínas es una excelente opción ya que son fáciles de preparar,
rentables y no contaminantes. Los polielectrolitos son polímeros de cadena
flexible que poseen grupos ionizables que pueden estar eléctricamente
cargados o que, bajo determinadas condiciones, adquieren carga eléctrica. Por
ello, pueden interaccionar entre sí, con iones de carga eléctrica opuesta y/o
pueden formar complejos con proteínas de carga eléctrica opuesta.
Algunos pueden formar geles debido a la capacidad que poseen sus
sustituyentes laterales de complejar determinados iones, en general,
divalentes. Pero, si se modifican las condiciones del medio, los mismos pueden
disolverse. Entonces, para sortear este problema, puede llevarse a cabo un
entrecruzamiento de los mismos con algún reactivo químico como
epiclorhidrina (1-Cloro-2,3-epoxipropano), de forma tal que se formen enlaces
covalentes entre las moléculas de polímero. De esta forma la matriz será
estable en ausencia de los iones que formaron el complejo, o frente a
variaciones de pH o fuerza iónica.
El objetivo principal de este trabajo fue el desarrollo de nuevas
técnicas bioseparativas no contaminantes, sintetizando lechos poliméricos para
utilizarlos como adsorbentes para la purificación de enzimas de importancia
biotecnológica e industrial.
Para ello, se desarrollaron matrices de alginato y carragenano, dos
polielectrolitos aniónicos naturales, a partir de la gelificación de una solución de dichos polisacáridos cuando entra en contacto con una solución de CaCl2. Las
esferas obtenidas fueron entrecruzadas covalentemente con epiclorhidrina, con
el objetivo de evitar su disolución en las diferentes condiciones de trabajo. Se
agregaron otros dos polímeros, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona, sobre la
matriz de alginato-carragenano a los fines de evaluar el efecto de dicho cambio
en la composición sobre la capacidad de adsorción de los diferentes lechos. A
su vez, se estudiaron dos tamaños de matrices: macro matrices, de un
diámetro promedio de 1,5 mm, y micro matrices, de un diámetro promedio de
0,5 mm.
Se caracterizaron morfológica y estructuralmente los diferentes lechos
obtenidos mediante el empleo de diversas técnicas como: espectroscopia
infrarroja, microscopía óptica y electrónica de barrido, difracción de rayos X,
termogravimetría y calorimetría diferencial de barrido. También se determinó la
cantidad de agua presente en los lechos.
Para estudiar la capacidad de adsorción de los lechos se procedió a
determinar las condiciones de trabajo que rindan la mejor adsorción de las
proteínas de trabajo: lisozima y peroxidasa. Las variables analizadas fueron el
pH, la fuerza iónica y la temperatura, ya que se conoce que son los factores
que afectan principalmente a los procesos de adsorción.
En el caso de la lisozima, las condiciones que rinden la mayor cantidad
de enzima adsorbida son: pH 6,20, sin el agregado de NaCl y a una temperatura de 35 °C. Para la peroxidasa, por su parte, se trabajó a pH 4,00,
en ausencia de NaCl y a una temperatura de 23 °C.
Una vez determinadas las condiciones óptimas de trabajo, se procedió a
estudiar la cinética y las isotermas de adsorción de la lisozima y la peroxidasa
sobre la matriz polimérica. Los resultados obtenidos fueron ajustados a
diferentes modelos: para las cinéticas, al modelo de pseudo-primer orden y
pseudo-segundo orden, y para las isotermas, a los modelos de Langmuir,
Freundlich y Hill.
Cuando se desea optimizar un protocolo de adsorción de proteínas con
el objetivo de purificarlas, la desorción de la enzima es tan importante como su
adsorción. Por ello se procedió estudiar la desorción de ambas enzimas
variando los factores que afectan la interacción entre la proteína y la matriz.
Para la lisozima se encontró que con el agrado de 750 mM de NaCl al buffer de
adsorción a pH 8,00 se logra la máxima recuperación de enzima adsorbida:
80% en todos los sistemas estudiados. En cambio, sólo se logró recuperar el
50% de la peroxidasa adsorbida cuando el pH se aumentó a 6.
Finalmente, los resultados obtenidos con la peroxidasa comercial fueron
tomados como referencia para la purificación de esta enzima a partir de una
fuente natural, un extracto de rabanito. Los resultados obtenidos indicaron un
bajo rendimiento y purificación de la enzima de interés. Estos resultados
pueden atribuirse al bajo porcentaje de desorción observado en el proceso de desorción con la enzima comercial, dado que se recupera menos de la mitad
de la peroxidasa adsorbida inicialmente.
Palabras clave
Adsorción, Polímeros, Lisozima, Peroxidasa