Estudio de la expresión renal de proteínas tubulares con diferentes funciones en ratas con colestasis extrahepática. Evaluación de proteínas apicales como posibles biomarcadores tempranos de daño renal

La colestasis extrahepática es una patología caracterizada por una disminución o ausencia del flujo de bilis desde el hígado hacia el intestino, debido a la presencia de una obstrucción en el conducto biliar. Como consecuencia, las sustancias que normalmente son excretadas por esta vía, como las sales biliares y la bilirrubina, retornan al torrente sanguíneo. Entre las posibles causas que subyacen a esta patología se pueden mencionar un tumor en el conducto biliar o el páncreas, una coledocolitiasis o una estenosis de origen cicatricial. A causa de la colestasis extrahepática, y según el tiempo de permanencia de la misma, el riñón también puede presentar alteraciones. Es poco lo que se conoce acerca de las alteraciones renales que se presentan en colestasis extrahepática, sobre todo a cortos de tiempo de evolución de la misma. Debido a que en esta patología la excreción hepática de compuestos a través de la bilis se encuentra impedida, el riñón, como otro órgano principal en la eliminación de sustancias del organismo, puede compensar esta función a través de la eliminación urinaria de compuestos que normalmente serían eliminados por la vía biliar. En conexión con esto, la expresión de transportadores de aniones orgánicos (Oat), como Oat1 y Oat3, también se encuentra alterada en la colestasis extrahepática. Los transportadores Oat1 y Oat3 se localizan en la membrana basolateral de las células del túbulo proximal, donde participan en la eliminación renal de compuestos de importancia farmacológica y toxicológica, como algunos antibióticos, diuréticos y antivirales, protegiendo así al organismo del posible efecto tóxico de estas sustancias. En particular, en un modelo de colestasis extrahepática de 21 h realizado a través de la ligadura del conducto biliar en ratas, se observó un aumento de la expresión proteica de Oat1 en homogenados y membranas basolaterales de corteza renal, mientras que la abundancia proteica de Oat3 aumentó en homogenados y se mantuvo sin diferencias en membranas basolaterales corticales. La expresión de toda proteína debe regularse estrechamente para llevar a cabo su función normal, lo cual puede incluir una regulación a largo plazo, que afecta la transcripción y traducción de la proteína, y una regulación a corto plazo que altera la estabilidad, la distribución y el tráfico, entre otros procesos. Previamente, otros autores han reportado la colocalización de Oat1 y Oat3 con las proteínas caveolinas, Cav-1 y Cav-2. Las caveolinas son proteínas transmembrana que forman microdominios de membrana especializados en combinación con colesterol y esfingolípidos, denominados caveolas. Las caveolas son un subtipo de lipid raft que funcionan como plataformas en las que es posible modular la localización, la estabilidad conformacional y la afinidad por ligando de las proteínas residentes. Además de la alteración en la expresión de transportadores renales, la colestasis extrahepática de 21 h en ratas, produce una alteración en el manejo renal de agua y osmoles, generando un aumento del flujo urinario y una disminución de la osmolalidad urinaria. En conexión con esto, cabe mencionar a dos proteínas involucradas en el manejo de agua y osmoles en el riñón. Por un lado, AQP2 que es un canal de agua localizado en las células del túbulo conector y colector renal, que cambia su localización apical o subapical según las necesidades de reabsorción de agua para generar una orina concentrada o diluida. Con respecto al manejo de electrolitos, NKCC2 se localiza en la rama ascendente gruesa del asa de Henle, donde realiza un transporte activo de electrolitos, reabsorbiendo NaCl hacia el líquido intersticial y contribuyendo en la creación del gradiente de concentración corticomedular. Por otro lado, en lo pertinente a la función renal, evaluada a través de los parámetros clásicos de uso habitual en la clínica, como uremia y creatininemia, no se observan alteraciones luego de 21 h de obstrucción biliar. Aun así, estudios precedentes en ratas con colestasis obstructiva de 72 h han demostrado una disminución de la velocidad de filtración glomerular, indicando, de esta manera, una alteración de la función renal. En este trabajo de Tesis, con el objetivo de profundizar en el conocimiento acerca de los cambios que subyacen a las alteraciones renales observadas en presencia de colestasis extrahepática en un estadio temprano de la patología, se planteó en primer lugar, analizar algunos componentes que pudiesen influir en la expresión y función de Oat1 y Oat3. Para esto, se evaluó el efecto de la incubación de células aisladas de corteza renal con sueros de ratas con colestasis extrahepática de 21 h. También se evaluó la distribución de las proteínas Oat1 y Oat3 en microdominios de membrana en animales controles y además se estudió si la colestasis extrahepática provoca una alteración en la distribución de estas proteínas entre dichos microdominios. Además se evaluó la expresión de Cav-1 y Cav-2 en animales con colestasis extrahepática. Luego, para profundizar en las alteraciones del manejo de agua y osmoles previamente observadas, se analizó la expresión proteica de NKCC2 y AQP2, dos proteínas involucradas en el manejo de electrolitos y agua, respectivamente, a nivel renal. Finalmente, se analizó la excreción urinaria de las proteínas apicales analizadas en tejido renal, en la búsqueda de potenciales biomarcadores tempranos que detecten las alteraciones funcionales que se producen posteriormente en el riñón a causa de la evolución de la colestasis extrahepática. Para ello, el modelo experimental elegido fue el de colestasis extrahepática por ligadura del conducto biliar común. Se trabajó con dos grupos experimentales, el grupo de animales controles, grupo Sham y el de animales que presentaron colestasis extrahepática, grupo BDL. En una primera instancia, se caracterizó la patología de colestasis extrahepática. Se observó un aumento de los marcadores bioquímicos clásicos de la patología, como la bilirrubina directa y la fosfatasa alcalina en plasma, los cuales se encontraron aumentados, demostrando la instauración de la patología en ratas BDL. También se observó un aumento en los niveles plasmáticos de sales biliares y colesterol total, compuestos que son secretados en la bilis, y que debido a la obstrucción biliar se acumulan en sangre; y de las aminotransferasas marcadoras de lesión hepática, alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa. Los parámetros indicativos de función renal, como uremia, creatininemia, fosfatasa alcalina en orina, y velocidad de filtración glomerular no mostraron alteraciones en animales BDL. Por otro lado, se halló un aumento del flujo urinario, y de la excreción fraccional de agua y osmoles. Luego, se evaluó el efecto directo de los sueros de ratas con colestasis extrahepática sobre la expresión proteica de Oat1 y Oat3 en células de corteza renal. Se observó que el suero BDL promueve un aumento de la expresión de Oat1 en membranas celulares, mientras que Oat3 se mantuvo sin diferencias significativas, como sucede en el modelo in vivo de colestasis extrahepática en ratas. De este modo, se halló que algún o algunos componentes presentes en el suero BDL son capaces de alterar la expresión proteica del transportador de aniones orgánicos Oat1. También se caracterizó la distribución de Oat1 y Oat3 en corteza renal de ratas control, específicamente entre microdominios caveolares (raft) y no caveolares (no raft) de la membrana plasmática. Se encontró una proporción mayor de Oat1 en la fracción raft de la membrana plasmática, respecto de la no raft. Para Oat3, la proporción localizada en la fracción raft y no raft fue similar. Estas observaciones indican que en un estado fisiológico, Oat1 y Oat3, a nivel renal, se encuentran asociadas con el dominio caveolar de la membrana, lo cual está de acuerdo con la colocalización de Oat1 y Oat3 con las proteínas Cav-1 y Cav-2, marcadoras de caveolas, reportado previamente. Posteriormente, considerando las alteraciones observadas en la expresión renal de Oat1 y Oat3 en presencia de colestasis extrahepática, se evaluó si esta patología afecta la distribución de dichas proteínas entre los microdominios raft y no raft de la membrana plasmática. Para Oat1, la colestasis extrahepática indujo una redistribución significativa de la proteína desde dominios raft hacia dominios no raft de la membrana. En el caso de Oat3, la patología no provocó una redistribución del transportador entre los microdominios de membrana. Por lo tanto, con este hallazgo existe evidencia de que el aumento en la expresión de Oat1 observado en membranas basolaterales de ratas BDL, se produce junto con el movimiento del transportador hacia la fracción no raft de la membrana plasmática. En esta parte del trabajo se evaluó también si la patología afecta a la distribución de Cav-1 y Cav-2, y al contenido de colesterol entre los microdominios raft y no raft, ya que los mismos son componentes característicos de los rafts caveolares. Ni la distribución de caveolinas, ni el contenido de colesterol en las caveolas, se encontraron alterados en presencia de colestasis obstructiva. También se evaluó el efecto de la colestasis obstructiva en la expresión de Cav-1 y Cav-2, a nivel de homogenados, membranas apicales y membranas basolaterales de corteza renal. En conjunto la patología provocó una disminución de la expresión de Cav-1 y Cav-2 en membranas apicales, y un aumento de las mismas a nivel basolateral, sin cambios en homogenados. Estos datos permiten inferir que, a nivel basolateral, la colestasis extrahepática promovería una translocación de Cav-1 y Cav-2 hacia la membrana. Por el contrario, en el lado apical, la patología induciría el tráfico de Cav-1 y Cav-2 hacia el citoplasma, o un vuelco de las mismas en la orina, como ha sido descripto para otras proteínas apicales en presencia de patologías renales. Las caveolinas han sido involucradas en una amplia variedad de procesos celulares, como la transducción de señal, el tráfico vesicular, el mantenimiento de los niveles de colesterol intracelular, entre otros. Por esta razón, la variación en la expresión de Cav-1 y Cav-2 hallada en las membranas apical y basolateral de células de corteza renal puede deberse a que las mismas estén influenciando diversos procesos en esta patología, tales como el tráfico vesicular o la transducción de señal. Posteriormente, considerando el aumento del flujo urinario y el aumento de las excreciones fraccionales de agua y osmoles en presencia de colestasis obstructiva, se analizó el efecto de la patología en la expresión proteica de NKCC2 y AQP2 en homogenados y membranas apicales de corteza y médula renal. Para NKCC2 en corteza, la patología no indujo cambios de su expresión proteica en homogenados y provocó una disminución de su abundancia en membranas apicales. A nivel medular, la expresión de NKCC2 no se modificó en colestasis extrahepática, tanto en homogenados, como en membranas apicales. AQP2, por su parte, no mostró variaciones en su expresión cortical, tanto en homogenados como en membranas apicales. En médulas, AQP2 disminuyó en homogenados y en membranas apicales en ratas BDL. La disminución de la expresión de NKCC2 en membranas apicales de corteza puede conllevar a una reducción de la hipertonicidad intersticial, disminuyendo la reabsorción de electrolitos y evitando, en consecuencia, la posterior reabsorción de agua. Por otro lado, la disminución de AQP2 a nivel medular conllevaría a una disminución de la reabsorción de agua en el túbulo colector, lo cual contribuiría al aumento observado previamente en el flujo urinario de animales BDL. Dado que previamente se ha reportado una posible relación entre las caveolinas y AQP2, en esta parte del trabajo también se evaluó la expresión de caveolinas en tejido medular en colestasis extrahepática. Los resultados indicaron una disminución significativa de Cav-1 y Cav-2 en membranas apicales medulares de ratas BDL, mientras que en homogenados se mantuvieron sin diferencias entre los grupos. Esta alteración en la expresión de Cav-1 y Cav- 2 en membranas apicales medulares podría influir en procesos que modifiquen la expresión de AQP2 en la membrana apical de las células principales del túbulo colector, la cual a su vez se mostró disminuida en colestasis extrahepática. Aun así, como fue mencionado anteriormente, las caveolinas podrían alterar su expresión para influenciar otros procesos biológicos en colestasis obstructiva, dada la variedad de procesos en los que participan. En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha trabajado en la búsqueda de biomarcadores urinarios que indiquen en forma temprana la presencia de alteraciones renales en otras patologías. En el modelo de colestasis obstructiva de 21 h en ratas, no se observan cambios significativos de la función renal, mientras que luego de 72 h de instaurada la patología se detecta una alteración de la función renal en ratas, asociada a una disminución de la velocidad de filtración glomerular. De este modo, resultó interesante evaluar el efecto de la colestasis extrahepática en la excreción urinaria de las proteínas apicales analizadas en este trabajo de Tesis: Cav-1, Cav-2, NKCC2 y AQP2, para explorar su potencial como biomarcadores urinarios de alteraciones renales en presencia de colestasis extrahepática. También se examinó la excreción urinaria de la Lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL), un biomarcador urinario de lesión renal descripto recientemente. Los resultados mostraron que la colestasis extrahepática induce un aumento significativo de la excreción urinaria de Cav-1 y Cav-2. Por otro lado, no se observaron modificaciones en la excreción urinaria de NKCC2, AQP2 ni NGAL en ratas BDL. Entonces, los niveles urinarios significativamente aumentados de Cav-1 y Cav-2 en colestasis extrahepática de 21 h, podrían representar biomarcadores tempranos, con el potencial de predecir subsecuentes alteraciones renales en tiempos mayores de colestasis obstructiva. Además, es importante resaltar que, en base a nuestro conocimiento, este es el primer trabajo en detectar la presencia de Cav-1 en orina de ratas control. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al conocimiento de las modificaciones inducidas por la colestasis obstructiva aguda en la expresión renal y en la excreción urinaria de proteínas con diferentes funciones a lo largo del túbulo renal. Estos conocimientos son de relevancia clínica debido al rol que cumplen estas proteínas en la función renal, y además, debido a su potencialidad como biomarcadores tempranos y no invasivos de alteraciones de la función renal frente a la colestasis obstructiva.