Diseño de un biosensor no invasivo para detectar el estado redox del NADP(H) en células vivas

Los procesos redox son esenciales para el desarrollo y la supervivencia de los seres vivos. Dentro de los diferentes pares redox, el NADP(H) cumple un rol central, proporcionando equivalentes reductores a múltiples vías biosintéticas, reguladoras y antioxidantes en todos los organismos vivos. No existe hasta ahora un procedimiento para monitorear selectivamente el estado redox de NADP(H) in vivo. La mayoría de los métodos existentes son invasivos o destructivos y/o se basan en ensayos in vitro. En este trabajo de tesis, fue diseñado y caracterizado un sensor no invasivo para determinar la fracción NADPH/NADP+ basado en las propiedades de roGFP2, una proteína verde fluorescente sensible a la reducción-oxidación, cuyas formas oxidada y reducida se excitan preferencialmente a dos longitudes de onda diferentes lo cual permite que sea ratiométrica y que se puedan realizar determinaciones basadas en la relación entre las dos excitaciones. El sensor roGFP2 fue fusionado a una proteína específica para NADP(H), la tiorredoxina reductasa C dependiente de NADPH (NTRC), que posee un dominio tiorredoxina C-terminal, y fue denominado NERNST (del inglés, NADP(H)-estimating ratiometric non destructive sensing tool). NERNST fue expresado en células de E. coli y caracterizado in vitro. Luego, fueron realizados ensayos in vivo a modo de pruebas de concepto en diferentes sistemas. Las propiedades de NERNST fueron investigadas mediante microscopía confocal en E. coli, pudiéndose estimar el potencial redox de NADP(H) en células que crecen en diferentes regímenes metabólicos. Además, fueron generadas plantas transgénicas estables de Arabidopsis y tabaco expresando el gen que codifica para NERNST, direccionando los productos a cloroplastos y a citosol, y fue analizada la respuesta del biosensor ante diferentes situaciones ambientales adversas, así como también en diferentes órganos de las plantas transformantes. Además, NERNST pudo ser expresado transitoriamente en plantas de N. benthamiana. Estudios en protoplastos aislados de hojas de plantas de Arabidopsis y tabaco transformadas de forma estable mostraron señales fluorescentes típicas de NERNST tanto en cloroplastos como en citosol, permitiendo estimaciones de ENADP(H) comparables a las obtenidas en hojas enteras. Resultados similares fueron obtenidos con protoplastos de plantas salvajes de Arabidopsis que fueron transformados transitoriamente usando los vectores empleados para el desarrollo de las anteriores. NERNST fue expresado en el citosol de células humanas en cultivo (HeLa y HEK-293T), y también fue direccionado a mitocondrias. El sensor fue empleado para estimar variaciones en el estado redox intracelular de NADP(H) por medio de la sobreexpresión de la NADPH oxidasa, que consume NADPH, y la inhibición de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que lo produce, así como la exposición a diferentes regímenes metabólicos. Por último, NERNST fue analizado en larvas de pez cebra como modelo de animal entero en conjunto con el sensor de H2O2, HyPerRed, pudiéndose detectar cambios en el pool de NADP(H) en respuesta a lesiones. En conjunto, los ensayos confirmaron que el biosensor NERNST refleja efectivamente los cambios esperados en el estado redox del pool de NADP(H) en todos los organismos ensayados.