Formación y caracterización por geles formados por caseinato de sodio y polisacáridos : propiedades fisicoquímicas, reológicos y estructurales

La comprensión del efecto de la composición y formas de procesamiento sobre el comportamiento micro y macroscópico de los alimentos es de gran importancia para el desarrollo de nuevos productos. Esto se puede conseguir a través del conocimiento de la estructura del alimento, de las interacciones entre sus componentes y de las fuerzas que determinan la consistencia y la estabilidad física de los productos. En particular, los alimentos lácteos pertenecen a un importante sector de la industria alimenticia, además de abarcar gran parte de los productos dietéticos del mercado. En nuestra región, el estudio de los componentes de la leche bovina, entre ellos las proteínas, es de suma importancia por hallarnos en una cuenca lechera. Las caseínas (CN) que constituyen el 80 % de las proteínas en la leche bovina, y sus derivados, los caseinatos (CAS), son utilizados como aditivos en diversos alimentos debido a su potencialidad de gelificar, formar espumas y emulsiones y también estabilizarlas. La gelificación o gelación de las CN puede realizarse por coagulación enzimática, acidificación o modificación de la fuerza iónica del medio. Las diferentes maneras de promover la gelación afectan la velocidad del proceso de agregación y, por tanto, las propiedades físicas del gel formado, como la textura y la capacidad de retención de agua del producto. La cinética de agregación de las proteínas y, por lo tanto, la textura final del producto, puede verse afectada por la modificación de las condiciones de procesamiento (tratamiento térmico, cizallamiento, pH), así como por la presencia de otros componentes como pequeños cosolutos o polisacáridos. Tales factores también afectan el grado de compatibilidad de las proteínas con los otros componentes del sistema. En particular, el uso de polisacáridos en alimentos es una práctica común en la industria, debido a sus propiedades funcionales como espesantes y gelificantes, pudiendo proporcionar características reológicas y de textura únicas. En una mezcla proteína/polisacárido, las situaciones más comunes son la separación de fases segregativa y asociativa que pueden llevar a la organización de los sistemas biopoliméricos en nano o micropartículas, a la formación de emulsiones agua-agua que son utilizadas en la industria alimenticia como substitutos de la grasa y a la producción de geles con características reológicas particulares. La construcción de nano y micropartículas abre una amplio espectro de aplicaciones, no sólo en la industria alimenticia, sino también en la farmacéutica y cosmética, por la posibilidad de incluir principios activos en los productos elaborados. Las proteínas de la dieta aportan los aminoácidos necesarios para el desarrollo y mantenimiento de células y tejidos de nuestro organismo. Como consecuencia de la digestión proteica, además de aminoácidos libres, se liberan péptidos. En estos últimos años existe un creciente interés por determinados fragmentos específicos de las proteínas que, además de su alto valor nutricional, posean actividad biológica que regule diferentes procesos fisiológicos. La literatura evidencia que estos péptidos bioactivos pueden atravesar el epitelio intestinal y llegar a tejidos periféricos vía circulación sistémica, pudiendo ejercer funciones específicas a nivel local, tracto gastrointestinal, y a nivel sistémico. Los péptidos bioactivos podrían alterar el metabolismo celular y actuar como vasorreguladores, factores de crecimiento, inductores hormonales y neurotransmisores. En este sentido, la hidrólisis de proteínas lácteas ofrece grandes posibilidades. Durante la misma, las proteínas son clivadas en péptidos de diferentes tamaños y aminoácidos libres, a través de hidrólisis química o enzimática. La última, bajo condiciones suaves de pH y temperatura, puede llevar al desarrollo de componentes nutricionales bioactivos y con propiedades funcionales optimizadas. La hidrólisis tiene como objetivos mejorar la estabilidad térmica, reducir alergenicidad, producir péptidos bioactivos, modelar cantidad y tamaño de los péptidos para dietas especiales, alterar propiedades funcionales de gelificación, emulsificación y formación de espumas. Enzimas proteolíticas producidas por Bacillus pueden ser utilizadas para hidrolizar proteínas en sistemas alimentarios. Estas proteasas son neutras y generan menos amargor en hidrolizados de proteínas alimentarias que las proteasas ácidas, por lo tanto, son de interés para la industria de alimentos. Además, su baja termotolerancia resulta ventajosa para el control de su reactividad durante la producción de hidrolizados. El objetivo de este trabajo de Tesis fue estudiar la formación de geles de caseinato de sodio (NaCAS) por acidificación inducida por la adición de glucono-d-lactona (GDL) y evaluar las modificaciones que dichos geles sufren en presencia de pequeños cosolutos (sacarosa, lactosa, glicerol, ión calcio), polisacáridos (carboximetilcelulosa, goma guar y goma xantana) o hidrolizados proteicos (obtenidos por acción de las proteasas neutras P45 y P7) a través de ensayos funcionales y estructurales, variando la composición del sistema y las condiciones de proceso. Las muestras obtenidas en los distintos tratamientos son heterogéneas (monómeros, agregados homogéneos y heterogéneos de distintos tamaños) y las mismas se caracterizaron de acuerdo a los pesos moleculares de las especies presentes mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en medio desnaturalizante (SDS-PAGE), en medio no reductor y reductor, y en condiciones nativas (sin SDS ni reducción) y en algunos casos, en presencia de urea (urea-PAGE). El estudio conformacional de las muestras obtenidas con los distintos tratamientos se llevó a cabo a través del análisis de los espectros de emisión de la fluorescencia intrínseca del aminoácido triptófano (Trp), que indicarían posible pérdida de estructura nativa y/o cambios en la polaridad del entorno proteico. Además, se determinó la hidrofobicidad superficial de la proteína por fijación del ligando hidrofóbico fluorescente 1-anilino-8-naftalén sulfonato (ANS) y la variación de la misma en presencia de diferentes cosolutos, polisacáridos y/o hidrolizados. En el caso de las mezclas NaCAS/polisacáridos se estudió la compatibilidad termodinámica. La curva binodial para cada sistema estudiado se obtuvo por un ajuste matemático exponencial decreciente. Además se realizaron curvas de solubilidad y estabilidad térmica de las mezclas. Los agregados y/o geles (según la concentración de NaCAS) fueron obtenidos por acidificación lenta del NaCAS hasta pH próximo a su punto isoeléctrico adicionando GDL. La cinética de la agregación inicial de las partículas se evaluó por medidas turbidimétricas, interpretando los resultados según deducciones desarrolladas por nuestro grupo de trabajo. Los posibles cambios de tamaño y/o grado de compactación fueron estudiados basándose en la dependencia de la turbidez con la longitud de onda en el rango de 450-650nm, rango en donde no hay absorción de los grupos cromóforos de la proteína. A partir de estos resultados se pudieron analizar las variaciones en la velocidad inicial del proceso de agregación y del grado de compactación de los agregados formados a la luz de la teoría de los fractales. Utilizando viscosímetros capilares y/o rotatorio se determinó la viscosidad de los distintos medios con el objetivo de analizar su efecto sobre la velocidad de difusión de las partículas durante la agregación. Se realizaron ensayos reológicos para estudiar las propiedades mecánicas de los geles ácidos obtenidos. Estos ensayos fueron realizados bajo cizallamiento para determinar las propiedades viscoelásticas de los sistemas, a bajas deformaciones y para evaluar los sistemas durante la formación de los geles y en el equilibrio. Para ello se utilizó un reómetro de tensión controlada y se estudió la cinética de la gelación, evaluando las variaciones de los módulos elástico (G’) y viscoso (G’’) con el tiempo. La microestructura de los geles ácidos obtenidos bajo las diferentes condiciones de procesamiento se estudió a partir de ensayos de microscopía óptica convencional y el posterior análisis de las imágenes digitales obtenidas. Para cada sistema se estimó el tamaño de poro promedio obtenido. El tamaño medio de las partículas y la distribución de tamaños se determinó en muestras representativas a fin de corroborar las determinaciones realizadas por microscopía y espectrofotometría, utilizando equipos de difracción láser adecuados para nano y micropartículas. Se aplicaron diseños de experimentos (completos y/o fraccionados) que permitieron evaluar la significancia de los distintos factores independientes estudiados (concentración proteica, concentración de polisacáridos, temperatura, cantidad de GDL adicionada) sobre las variables dependientes o respuestas analizadas (tiempo y pH al cual comienza la agregación y/o gelación, dimensión fractal de los agregados formados y grado máximo de elasticidad alcanzado por los geles). Se obtuvieron gráficos de contorno, de superficie y ecuaciones modelo que permitieron evaluar y predecir el comportamiento de los sistemas bajo las diferentes condiciones ensayadas. Las enzimas proteolíticas P45 y P7 fueron producidas a partir de los cultivos bacterianos de Bacillus sp. P45 y Bacillus sp. P7, aislados de peces de la cuenca Amazónica. A todas las fracciones de enzimas obtenidas se les midió su actividad proteolítica por el método de la azocaseína. Las proteasas fueron caracterizadas fisicoquímicamente por ensayos espectrofotométricos y espectrofluorométricos. Se obtuvieron los hidrolizados proteicos, se determinó el grado de hidrólisis alcanzado en cada caso y se analizaron los pesos moleculares de los péptidos resultantes por PAGE. Se evaluó la bioactividad in vitro de los péptidos obtenidos a diferentes tiempos de hidrólisis. Se estudió la actividad antimicrobiana frente a diferentes microorganismos patógenos, la actividad antioxidante (mediante los métodos TBARS, ABTS y DPPH), el poder reductor y la capacidad quelante de hierro. El estado conformacional de los hidrolizados se evaluó mediante ensayos de espectrofluorimetría. Por otro lado, se estudió la capacidad de agregación de cada hidrolizado ante la adición de GDL y el efecto que produjo la incorporación de los mismos sobre la cinética de agregación, las características reológicas de geles de NaCAS y la microestructura de los mismos. Según los resultados obtenidos, el proceso de agregación/gelación del NaCAS presentó dos etapas bien definidas. En la primera, más lenta y, por lo tanto, la que determina la velocidad total del proceso, se detectó una disminución del tamaño medio de las partículas, debido a la existencia de un proceso de disociación de las partículas de NaCAS. En la segunda etapa, ocurre la agregación espontánea de las partículas coloidales que han perdido su estabilidad electrostática por el descenso del pH, etapa donde se reveló el aumento brusco del tamaño particular hasta que el agregado llega a su crecimiento y grado de compactación máximo caracterizado por la dimensión fractal. Se comprobó que los sitios que participan en las interacciones interparticulares se encontrarían cercanos a los grupos cromóforos del NaCAS. Este proceso resultó dependiente de la concentración proteica, la cantidad de GDL adicionada y la temperatura de trabajo, de modo tal que una variación de cualquiera de estos parámetros, llevó a una modificación principalmente de la primera etapa y, por ende de la estructura de los agregados finales. Se observó que la elasticidad de los geles formados durante la gelación proteica dependió tanto de la concentración proteica como de la cantidad de GDL adicionada. Además, los geles formados a menor velocidad de gelación (menor cantidad de GDL adicionada), muestran una mayor estructuración, presentando un aspecto más compacto y poros de menor tamaño. Esto se debe a que, si el proceso se realiza lentamente, la malla de gel puede reestructurarse por ruptura de algunas interacciones y formación de otras nuevas, obteniéndose una malla más apretada y, por lo tanto, con poros cada vez más pequeños. Por lo tanto, el grado de compactación y el tamaño de los poros del gel dependieron de la velocidad de gelación, la cual está relacionada en forma directa con la cantidad de GDL adicionada. La adición de sacarosa, lactosa y glicerol aumentaron la viscosidad del medio y afectaron la hidrofobicidad superficial del NaCAS dependiendo de la naturaleza y concentración de los mismos. Esta variación estaría vinculada con la exclusión preferencial de cada cosoluto de la superficie proteica. Además los cosolutos afectaron la cinética de agregación del NaCAS como también la elasticidad de los geles ácidos formados. En presencia de sacarosa los geles presentaron una malla más fina y homogénea, con un tamaño de poros promedio menor, lo que implicaría un aumento de la interconectividad de la red de gel que incrementa la rigidez o elasticidad del mismo. Por su parte, la lactosa presentó un efecto opuesto, comportamiento que estaría vinculado, por un lado con la naturaleza química del disacárido que generaría un impedimento estérico para las interacciones CN-CN, y por otro con el aumento de la viscosidad del medio, dificultando la difusión de las partículas unas a otras y, por lo tanto, disminuyendo la probabilidad de interaccionar entre ellas. La presencia del ión calcio produjo un significativo cambio en el estado inicial de las partículas de NaCAS, vinculado a la fijación del mismo a los residuos fosfoseril y/o carboxilatos de la proteína. La estabilidad electrostática de las partículas coloidales disminuyó como consecuencia de una reducción en la carga neta, favoreciendo las fuerzas intermoleculares durante el proceso de gelación. El grado de compactación de los agregados y la elasticidad de los geles formados dependieron de la concentración de calcio empleada. Esta diferencia en la elasticidad final de los geles ácidos formados en presencia de distintas concentraciones de calcio puede ser atribuida a cambios conformacionales de las partículas coloidales y a modificaciones cinéticas durante el proceso de gelación. La adición de polisacáridos al NaCAS generó cambios en la solubilidad de los sistemas, en la conformación proteica y en las propiedades funcionales dependiendo del tipo y concentración del polisacárido. La carboximetilcelulosa (CMC) provocó un efecto estabilizante sobre el NaCAS en solución, debido a la adsorción de la misma en la superficie proteica, incrementando así la carga neta negativa. La cinética de agregación del NaCAS en presencia de CMC también se vio afectada. Se observó un aumento del tiempo en que se forman los agregados y una disminución del pH al cual comienza la agregación a medida que aumenta la proporción de CMC en la mezcla. Esto afectó la dimensión fractal de los agregados formados, disminuyendo el grado de compactación de los mismos a medida que aumentó la cantidad de polisacárido adicionada. Por otra parte, las características reológicas de los geles dependieron de la composición relativa de las mezclas NaCAS:CMC; se pueden obtener geles de diferente textura variando la relación proteína:polisacárido, debido a que se parte de un estado inicial diferente con formación de micropartículas inducido por la presencia del polisacárido. Además, los geles de mezclas NaCAS:CMC se formaron a muy bajos valores de pH lo cual podría aprovecharse para su utilización como vehículo de principios activos que se deseen incorporar por vía digestiva. La adición de goma guar (GG) a soluciones acuosas de NaCAS produjo un cambio conformacional con exposición al medio de los fluoróforos intrínsecos proteicos. Las mezclas NaCAS:GG no mostraron cambios significativos en la estabilidad térmica pero se observó incompatibilidad termodinámica a concentraciones de NaCAS mayores a 3% y/o de GG mayores a 0,2%. El tamaño medio inicial de las partículas de las diferentes mezclas fue mayor a medida que aumentó la proporción de GG, lo que indicaría una formación inicial de micropartículas. Se comprobó que el tiempo al que comienza la agregación dependió de la cantidad de GDL adicionada y de la temperatura, siendo el efecto de la primera variable mucho más significativo. El valor de pH que hay que alcanzar para desestabilizar al NaCAS varió según la temperatura y la concentración de GG; vinculándose esta última dependencia al grado de compatibilidad termodinámica entre el polisacárido y la proteína. El grado de compactación de los agregados, estimado a través de la dimensión fractal, resultó independiente de todos los factores evaluados. A partir de los ensayos reológicos se comprobó que la elasticidad final de los geles obtenidos dependió de todas las variables ensayadas. La microestructura de los geles resultó afectada por la temperatura y por la cantidad de GDL adicionada. Este resultado tiene estrecha relación con la velocidad de formación de la malla de gel. Por lo expuesto, la GG podría utilizarse para la obtención de micropartículas de NaCAS como posible vehículo de principios activos, con diferentes texturas de acuerdo a la concentración relativa de los biopolímeros y a las condiciones del proceso. La adición de goma xantana (GX) a las soluciones de NaCAS, originó incompatibilidad termodinámica en todo el rango de concentraciones de la proteína y el polisacárido. La GX es un polisacárido aniónico y el NaCAS tiene, al pH isoiónico carga neta negativa, por lo tanto, la repulsión electrostática generada por cargas de igual signo conduciría a la separación de fases. También se observó desestabilización térmica de las mezclas NaCAS:GX, la cual se incrementó con el aumento de proporción de GX. Estos resultados indican que el aumento de temperatura induciría la separación de fases en presencia de GX. Por otra parte, la presencia del polisacárido produjo cambios conformacionales del NaCAS vinculados a una modificación del entorno de los fluoróforos intrínsecos proteicos hacia un medio más polar a medida que aumenta la proporción de GX. Se comprobó que la cinética de agregación ácida del NaCAS en presencia de GX dependió de la cantidad de GDL adicionada y de la temperatura, siendo ambos factores igualmente significativos, aunque resultó independiente de la concentración de GX empleada. La dimensión fractal de los agregados formados dependió levemente tanto de la temperatura como de la concentración del polisacárido. Sin embargo, al evaluar las propiedades reológicas y la microestructura de los geles obtenidos en presencia y ausencia de GX, se observó que un aumento de la concentración del polisacárido conduce a geles más elásticos y compactos. El grado de hidrólisis proteica con la enzima P45 aumentó hasta las dos horas de incubación, alcanzándose péptidos con pesos moleculares menores a 6,5 kD. La hidrofobicidad superficial de los mismos disminuyó a medida que aumentó el tiempo de hidrólisis. La actividad antioxidante de estos péptidos se evaluó por los métodos DPPH y TBARS. Se observó que sólo el hidrolizado obtenido luego de una hora de incubación (t1) y el control (t0) presentaron bioactividad. Además, solo el hidrolizado t1 presentó actividad antimicrobiana contra Salmonella enteritidis. Cuando se evaluó la capacidad de agregación de los hidrolizados frente a la acidificación, se observó que sólo los hidrolizados t1 mantuvieron la capacidad para agregar luego de adicionada la GDL. Esto coincidió con la brusca disminución de la hidrofobicidad superficial, lo que demuestra la participación de las interacciones hidrofóbicas durante el proceso de agregación. Los geles finales obtenidos fueron menos compactos y estructurados. Por otro lado, la incorporación de los hidrolizados bioactivos a soluciones de NaCAS modificó la cinética de agregación ácida pero no alteró significativamente el grado de compactación de los agregados formados; los geles obtenidos a partir de la mezcla NaCAS:hidrolizado t1 presentaron una elasticidad y microestructura similar a las de los geles de NaCAS. La hidrólisis enzimática del NaCAS con la enzima P7 produjo péptidos de pesos moleculares menores a 6,0 kD que presentaron diversas bioactividades (antimicrobiana, antioxidante, quelante y poder reductor), cuya magnitud dependió del tiempo de hidrólisis. Estos hidrolizados perdieron la capacidad de gelificar por adición de GDL, y su incorporación a soluciones concentradas de NaCAS no modificó la cinética de gelación pero si la elasticidad de los geles formados, sin variación significativa del tamaño promedio de sus poros. Estos resultados son prometedores con respecto a la incorporación de péptidos bioactivos como aditivos en la elaboración de diferentes productos lácteos, donde la agregación y gelación ácida constituya la base para su producción. Sin embargo, se debe tener en cuenta su efecto sobre las propiedades reológicas y de textura de los geles formados, ya que las mismas pueden modificar las características organolépticas del producto final.