Control del crecimiento y desarrollo de las plantas por medio del sistema GRF

La familia de factores de transcripción (FT) GRFs (del inglés, GROWTH-REGULATING FACTORS) es específica de plantas y se caracteriza por ser regulada post-trascripcionalmente por el microARN (miARN) miR396. A su vez, los GRFs actúan en conjunto con miembros de una familia génica de co-reguladores transcripcionalesllamada GIF (del inglés, GRF-INTERACTING FACTORS). El nodo miR396-GRF/GIF cumple importantes funciones en diversos procesos del desarrollo de la planta. Los GRFs en Arabidopsis son capaces de modificar el tamaño de las hojas y flores controlando la proliferación celular en las primeras etapas del desarrollo como así también el proceso de senescencia de las hojas. En este trabajo de Tesis se propuso descifrar las redes génicas reguladas por el sistema GRF utilizando Arabidopsis thaliana como organismo modelo. Además, se planteó caracterizar el sistema GRF/GIF en trigo. En una primera instancia se analizaron microarreglos de plantas con distintos niveles de expresión de los GRFs. Se encontró que la familia de FT ZF-HDs (del inglés, ZINC FINGERS HOMEODOMAIN), sería regulada positivamente por los GRFs. El estudio de cruzas de plantas que expresan un miARN artificial contra la familia ZF-HD (amiRZF-HDs) con plantas con niveles aumentados de GRF3 indicó que los genes de la familia ZF-HDs se expresarían corriente abajo de GRF3. El análisis del promotor de HB33, uno de los miembros de la familia ZF-HDs, indicó que el mismo presentaba el motivo de unión al ADN propuesto para los GRFs y mediante ChIP-qPCR (Inmunoprecipitación de la Cromatina seguido de PCR cuantitativa) se validó esta interacción. La mutante simple de HB33 no mostró defectos significativos en su crecimiento y desarrollo. Sin embargo, la expresión de HB33 fusionado a un dominio super-represor resultó en plantas con severos defectos en el desarrollo, indicando la importancia de esta familia de genes en el desarrollo temprano de Arabidopsis. Al sobre-expresar HB33 de forma moderada se encontró que las plantas presentaban hojas más grandes que las silvestres y con retardo en la senescencia de las hojas, fenotipo semejante al observado en las plantas con altos niveles de GRF3. Estos fenotipos se pudieron desacoplar expresando a HB33 bajo el control del promotor ANT (AINTEGUMENTA), que se expresa solo en el desarrollo temprano de la hoja. Las plantas pANT:HB33 presentaron aumento del tamaño de la hoja sin afectar la senescencia. A su vez, la cruza de rGRF3 con hb33 suprimió el retardo en la senescencia característico de rGRF3. Estos resultados indican que HB33 sería regulado directamente por GRF3 y tendría implicancias tanto en procesos tempranos del desarrollo de la hoja como en el proceso de senescencia. Luego, se realizaron experimentos de transcriptómica utilizando ápices y puntas de raíces de plantas de Arabidopsis transformadas con versiones inducibles de GIF1 y/o GRF3. En raíces, se encontró que luego de la inducción varios genes implicados en el mantenimiento del meristema fueron reprimidos, mientras que, en parte aérea se encontraron incrementados genes con funciones conocidas en el ciclo celular y en la replicación del ADN. El estudio de los genes blancos del sistema GRF/GIF en los dos meristemas analizados sugiere que el sistema participa en redes regulatorias génicas diferentes en los distintos órganos de las plantas. Por último, en colaboración con el laboratorio del Dr. Jorge Dubcosvky, se estudió el sistema miR396-GRF/GIF en trigo utilizando una población de mutantes TILLING (del inglés, Targeted Induced Local Lesion in Genomes) en trigo tetraploide secuenciada. Primero se determinaron los homólogos de los GRFs en trigo y se seleccionaron mutantes en el sitio de unión de miR396 en los GRFs de la población TILLING. Luego de realizar cruzamientos para limpiar las líneas de otras mutaciones se analizaron las correspondientes plantas. Se encontró aumento en el tamaño de los granos en dos de las líneas mutantes. Conjuntamente, se caracterizaron plantas sobre-expresantes del cofactor GIF1. Estas plantas presentaron aumento en el largo de las hojas e incremento en el tamaño de los granos. Los resultados preliminares en trigo son alentadores sugiriendo que modificaciones en este sistema pueden utilizarse para aumentar el rendimiento de este cereal.