Desarrollo de un enzimoinmunoensayo para la identificación de aislamientos de Escherichia coli O157:H7 y Escherichia coli no O157 productores de Shigatoxina de origen clínico y alimentario

Escherichia coli shigatoxigénica (STEC) es un patógeno emergente responsable de casos esporádicos de diarreas y de brotes asociados a la ingesta de alimentos contaminados. La enfermedad causada por STEC se caracteriza por dolor abdominal y diarrea acuosa que puede progresar a diarrea con sangre y colitis hemorrágica. Las complicaciones tales como el Síndrome Urémico Hemolítico se desarrollarán en el 5% al 15% de estos casos. STEC produce una o más toxinas Shiga (Stx1, Stx2 y sus variantes), las cuales representan su principal factor de patogenicidad, responsables de las complicaciones intestinales y sistémicas. Numerosos métodos diagnósticos han sido desarrollados para la detección de STEC, entre ellos, los culturales, los inmunológicos y los genéticos. La metodología clásica para el diagnóstico de STEC O157:H7 implica el aislamiento del microorganismo mediante el cultivo, seguido de la confirmación bioquímica e inmunológica. Sin embargo, estos métodos de cultivo tradicionales, incluyendo el agar MacConkey sorbitol, no revelan la presencia de STEC no O157, y las técnicas necesarias para la detección de estos microorganismos están más allá del alcance de la mayoría de los laboratorios de rutina. La detección de la Stx por medio de enzimoinmunoensayos (ELISA) o por métodos moleculares que detectan los genes codificantes de las toxinas Shiga se presentan como métodos alternativos para la detección de las STEC no O157. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue desarrollar dos sistemas de enzimoinmunoensayos para la detección de Escherichia coli O157 y Escherichia coli no O157 productoras de Shigatoxinas asociadas a diarreas mucosanguinolentas o a brotes alimentarios con el propósito de contribuir al diagnóstico de estos patógenos prevalentes en nuestra región, de difícil caracterización y cuya identificación permite un abordaje diferencial a nivel terapéutico y de vigilancia. Para cumplir con los objetivos planteados se seleccionaron aislamientos bacterianos, de origen clínico y alimentario, y muestras de materia fecal de pacientes con diarrea. Los aislamientos y las muestras clínicas fueron empleados en los ensayos de estandarización y validación de los prototipos desarrollados. La estandarización de los ELISA implicó el análisis de los anticuerpos de captura, secundarios y conjugados, el sustrato y las concentraciones de trabajo óptimas de cada uno de ellos que se utilizaron en la producción de estos equipos. La validación consistió en la determinación de parámetros tales como sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos, límite de detección, valor de corte, presencia de reacciones cruzadas, precisión intermedia y repetibilidad y estabilidad térmica de los componentes del ELISA. En el caso del ELISA-O157, desarrollado para detección de STEC O157, presentó una sensibilidad y una especificidad del 100%, con un grado de concordancia muy bueno con la técnica de cultivo y la PCR. Se determinó el valor de corte de la técnica y, en ese punto, la sensibilidad fue del 100% y la especificidad del 98%. El límite de detección de este equipo fue de 106 UFC/mL de Escherichia coli O157. No se observaron reacciones cruzadas con los diferentes microorganismos bacterianos y fúngicos ensayados, tanto de origen clínico como alimentario. La precisión intermedia y repetibilidad fue aceptable, con un coeficiente de variación menor al 20%. La estabilidad térmica ensayada demostró que la vida útil del equipo completo fue de 9 meses. Por otra parte, el ELISAStx2, desarrollado para la detección de STEC productora de Stx2, presentó una sensibilidad del 80% y una especificidad del 100%, con un grado de concordancia muy bueno con la técnica de PCR y con el ELISA comercial Ridascreen® Verotoxin. Se determinó el valor de corte del método y se calculó la sensibilidad y la especificidad en ese punto que resultaron del 100% y del 98%, respectivamente. El límite de detección de este equipo fue de 106 UFC/mL de STEC productoras de Stx2. No se observaron reacciones cruzadas con los diferentes microorganismos bacterianos y fúngicos ensayados, tanto de origen clínico como alimentario. Este equipo presentó una precisión intermedia y repetibilidad aceptable, con un coeficiente de variación menor al 20%. La vida útil del equipo completo fue de 7 meses. Finalmente, el análisis de costos de ambos equipos demostró que estos ELISA representaron una metodología económica en comparación con las técnicas de cultivo y moleculares evaluadas en este trabajo. Los ensayos desarrollados en esta tesis podrían reproducirse en un formato comercial, ya que los estudios de validación demostraron una estabilidad y un desempeño comparable con los equipos comerciales. Además, estos ensayos podrían ser utilizados en conjunto como métodos alternativos o complementarios a los establecidos para el diagnóstico y vigilancia de STEC.