Mecanismos moleculares en la interacción Prunus persica–Taphrina deformans

Las plantaciones de duraznos (Prunus persica) son amenazadas por distintos patógenos como lo es el hongo fitoparásito biotrófico Taphrina deformans. Éste es el agente causal del Torque de la hoja del duraznero. Esta enfermedad no solo tiene efectos directos en el rendimiento y en la calidad de la fruta, sino que compromete la salud general y el vigor de los árboles, haciéndolos más vulnerables a otros estreses bióticos y abióticos, generando pérdidas económicas indirectas pero devastadoras. El Torque se caracteriza por el engrosamiento y enrulamiento de las hojas, acompañado de un cambio en su coloración hacia los rojos y los violetas. Este trabajo de Tesis se centra en el estudio de la interacción entre P. persica y T. deformans, con énfasis en las respuestas del hospedador, con el fin generar conocimiento científico sobre este patosistema para que en el futuro pueda contribuir a la prevención, diagnóstico y control del Torque. El tema de investigación se abordó mediante dos enfoques y se trabajó con tres genotipos con susceptibilidad contrastante: Flavorcrest (FL, susceptible), y las líneas hermanas DOFI84.364.089 (DS, susceptible) y DOFI-84.364.060 (DR, resistente). En el primero se caracterizaron las respuestas tempranas, tanto en el genotipo resistente como en los susceptibles, cuando el hospedador se encuentra con el patógeno con el fin de descifrar las bases moleculares que le confieren la resistencia al genotipo DR. En el segundo enfoque se trabajó con hojas del genotipo DS naturalmente infectadas a campo y que presentan la sintomatología característica del Torque, a fin de obtener un panorama de la reprogramación celular y de los cambios metabólicos que ocurren en las hojas del duraznero una vez que la enfermedad se ha establecido en el hospedador. Así, en la primera de la Tesis se abordó con una perspectiva integral donde se aplicaron técnicas como la transcriptómica, la hormonómica y la proteómica, las cuales fueron complementadas con otros análisis bioquímicos a fin de evidenciar los cambios que el hongo desencadena en el huésped al principio de la infección. Con este fin, se inocularon hojas de las variedades DS, DR y FL en condiciones controladas y se tomaron muestras a las 0, 12 y 96 horas post inoculación (hpi) y se comparó el comportamiento de las muestras inoculadas con respecto a las de 0 hpi. Los cambios más prominentes ocurrieron a las 96 hpi, cuando T. deformans ya había completado el dimorfismo hacia la fase filamentosa. Se encontraron respuestas comunes y específicas de cada variedad. La transcriptómica diferencial llevada a cabo en muestras de DS y DR mostró una mayor cantidad de genes diferencialmente expresado (DEGs) reprimidos que inducidos al comparar las muestras inoculadas con las muestras correspondientes al tiempo cero. El estudio permitió identificar un conjunto de genes codificantes de proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) que estarían involucradas en el mecanismo de defensa. Los resultados señalan la síntesis de compuestos cianogénicos y la producción de HCN en ambos genotipos. Además, los datos sugieren que en las hojas inoculadas se produce el reciclado, reordenamiento y reorganización de la pared celular, la principal barrera de defensa con la que cuentan las células. A su vez, el análisis in silico de los genes diferencialmente expresados con un mismo perfil de expresión permitió identificar a los factores de transcripción (FTs) WRKY72 y WRKY75, y a ABI5 y MYB101 como responsables putativos de la co-regulación de un grupo de genes en DR y en DS, respectivamente. Mediante el perfilado hormonal se cuantificaron exitosamente 41 hormonas, precursores y productos de su degradación que incluyen brasinoesteroides, auxinas, ácido salicílico, etileno, jasmonatos, ácido abscísico y citoquininas; representando el primer estudio hormonómico en hojas de duraznero. Las auxinas, el etileno y los abscisatos fueron modulados únicamente en DS. Los resultados indican que la defensa podría estar principalmente mediada por el etileno mientras que el ác. abscísico estaría involucrado en la regulación de ciertos grupos de genes. Por otro lado, el aumento en el contenido de ácido salicílico, exclusivo de DR, junto con la presencia de cajas de respuesta a esta hormona en los promotores de genes regulados exclusivamente en DR y con función putativa en la defensa, señalan que esta hormona podría mediar, al menos en parte, los eventos bioquímicos que se relacionan con la resistencia característica de DR. Debido a que T. deformans no penetra en la célula, sino que invade y se desarrolla en el espacio apoplástico, se caracterizó el proteoma del apoplasto en hojas de los genotipos FL y DR. La mayor parte de las proteínas fueron misceláneas y no caracterizadas indicando el basto conocimiento que aún queda pendiente por desentrañar en cuanto a las proteínas apoplásticas. El análisis del proteoma diferencial de muestras colectadas a las 12 y 96 vs. las colectadas a las 0 hpi nuevamente mostró la acumulación diferencial de proteínas relacionadas con la reorganización de la pared celular y señaló al apoplasto como un compartimento clave como fuente de proteínas que participan en la percepción y respuesta a patógenos. En la segunda etapa de la Tesis, se diseccionaron y analizaron áreas sintomáticas y asintomáticas de hojas DS con un grado avanzado de la enfermedad (G7) y se compararon con hojas sanas (G0). Se llevó a cabo un enfoque integrado que incluyó metabolómica, lipidómica, proteómica y técnicas bioquímicas complementarias para comprender los desequilibrios bioquímicos que la enfermedad genera en las hojas. Se identificó un comportamiento metabólico diferencial en las áreas sintomáticas en comparación con las áreas asintomáticas o G0. Las regiones sintomáticas se caracterizaron por un funcionamiento y composición cloroplásticos alterados, que incluyen una disminución en la maquinaria fotosintética, alteración en la composición de lípidos plastídicos, disminución de los polímeros y azúcares de reserva y un detrimento de pigmentos fotosintéticos. Los cambios fueron acompañaron de disminuciones en las proteínas relacionadas con la homeostasis redox del cloroplasto y en el índice de doble enlace de los triacilgliceroles. Los metabolismos secundario y de aminoácidos fueron alterados en áreas sintomáticas. La proteómica diferencial reveló la inducción de las vías de los fenilpropanoides y del ácido mevalónico; y la represión de la ruta del fosfato de metileritritol que tiene lugar en los cloroplastos. Además, la composición de aminoácidos fue afectada, con una inducción de proteínas involucradas en la síntesis de la asparagina, que acompañaron el incremento de este aminoácido. En conjunto, los datos obtenidos en la metabolómica y en la proteómica indican un cambio metabólico en las áreas sintomáticas que pasan de ser tejidos fuente, es decir, tejidos fotosintéticos productores de fotoasimilados, a ser tejidos sumidero, que importan azúcares y producen energía a través de la fermentación y la respiración; y obtienen el poder reductor de la ruta de las pentosas fosfato. De esta manera, a medida que progresa la enfermedad, las áreas asintomáticas y las hojas sanas producen menos fotosintatos, limitando la producción de frutas y, en última instancia, la supervivencia de las hojas y de los árboles. Por último, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis permitieron la identificación de genes y proteínas que podrían contribuir con un sistema general de defensa, común a todos los genotipos estudiados. Ciertos grupos de PRs que incluyen a las PR5, PR14 y a las relacionadas a la quitina (PR3, PR4, PR8 y PR11) y a la pared celular fúngica (PR2) fueron inducidas tanto a nivel de transcripto como de proteína en etapas tempranas de la infección y cuando la enfermedad ya ha establecido. Por otro lado, también se detectó otro grupo de proteínas candidatas que podrían formar parte de la estrategia de defensa específica de DR tales como la PR10, la PR12 y la PR17. A su vez, las proteínas puente de Berberina podrían participar del estallido temprano de especies reactivas del oxígeno que se registra en DR y también podrían estar colaborando en la defensa. En síntesis, el desarrollo de este trabajo de Tesis aportó al entendimiento de los mecanismos moleculares y procesos fisiológicos asociados a la estrategia de defensa de P. persica inducida por el ataque de T. deformans, además de contribuir a elucidar y descifrar las bases moleculares de la resistencia del genotipo DOFI-84.364.060 al Torque de la hoja de duraznero. Por otra parte, se avanzó en el entendimiento de los cambios a nivel fisiológico y bioquímico que tienen lugar en la hojas con Torque.