Estudio de la interacción de TcHMGB con otras proteínas en el contexto nuclear del parásito Trypanosoma cruzi

El parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica global de gran importancia en América Latina. Actualmente solo existen dos medicamentos para tratarla, ambos efectivos en la etapa aguda de la enfermedad, pero no durante la etapa crónica. T. cruzi posee un genoma con una estructura y una regulación génica inusual para eucariotas: sus genes se transcriben en tándem en grandes unidades policistrónicas y carece de promotores canónicos y de factores de transcripción clásicos. En este contexto, los mecanismos de regulación epigenética adquieren un rol central en el control del inicio de la expresión génica y otros procesos nucleares. Las High Mobility Group B (HMGB) son un grupo de proteínas consideradas factores arquitectónicos de la cromatina, muy conservadas en eucariotas. En nuestro grupo de investigación, hemos identificado y caracterizado la proteína HMGB de T. cruzi (TcHMGB), la cual comparte dominios de unión al ADN con sus ortólogas, pero cuenta con un extremo amino terminal (N-terminal) exclusivo de kinetoplástidos. Hemos observado que TcHMGB se expresa en el núcleo en todas las etapas del ciclo de vida del parásito, que reconoce y se une de manera preferencial a estructuras distorsionadas del ADN, que puede inducir curvatura en la doble hélice y que modifica la estructura de la cromatina haciéndola más laxa. Ensayos de RNA-seq con parásitos sobreexpresantes de TcHMGB, sugieren que la proteína tendría un rol global en la transcripción de genes, particularmente en la región disruptiva del genoma. Consideramos que TcHMGB podría estar afectando esta región al unirse y hacer más laxa la cromatina. Para continuar con el estudio de esta proteína, que parece ser esencial para el parásito, decidimos identificar con qué proteínas interectúa en el entorno nuclear utilizando la técnica de marcado por proximidadbcon TurboID. Con este fin, obtuvimos un plásmido capaz de expresar TcHMGB fusionada a TurboID y a una etiqueta de 3 HA, cuya identidad verificamos por PCR, digestión con enzimas de restricción y secuenciación. Posteriormente, utilizamos este plásmido para transfectar una cepa de T. cruzi y obtuvimos parásitos capaces de expresar la proteína de fusión (3xHA-TurboID-TcHMGB) bajo inducción con tet. Evaluamos la presencia del plásmido en los parásitos por PCR, verificamos expresión de la proteína mediante Western blot, y corroboramos que posee localización nuclear realizando ensayos de inmunocitolocalización. Además, optimizamos la concentración del inductor necesaria para realizar futuros ensayos de interactómica basados en marcado por proximidad con TurboID. Así logramos obtener una cepa de T. cruzi que permitirá realizar ensayos para determinar el perfil de interactómica de TcHMGB en el entorno nuclear, para poder determinar con más detalle su rol en la regulación de la expresión génica y/u otros procesos nucleares.