Diseño y evaluación in-vitro/in-vivo de sistemas poliméricos micro- y nanoparticulados de fármacos

El presente trabajo aborda la formulación y caracterización de diferentes sistemas micro- y nanoparticulados de glibenclamida, benznidazol, praziquantel y fenbendazol. Todos estos son fármacos empleados como antiparasitarios, pero al ser muy poco solubles en agua presentan una baja absorción y errática biodisponibilidad. Con el objetivo de mejorar la solubilidad y velocidad de disolución de glibenclamida, se formularon diferentes sistemas nanoparticulados. Se evaluó el uso de diversos biomateriales en la formulación de nanopartículas. Para esto fueron evaluados: Eudragit RLPO, P-188, P-407 y polietilenglicol 6000, empleando diferentes metodologías de agitación y secado posterior. También se formularon nanopartículas de glibenclamida conteniendo Eudragit RLPO, P-188, P-407 y polietilenglicoles de diferentes pesos moleculares. Finalmente, se llevó a cabo un diseño de experimentos para la preparación de dichas nanopartículas, seleccionando las mejores condiciones de formulación. Todos los sistemas formulados fueron luego caracterizados fisicoquímicamente e in-vitro. Estos sistemas nanoparticulados permitieron un aumento en la solubilidad acuosa de dicho fármaco de más de 6 veces. Los resultaron demostraron que la velocidad de disolución de glibenclamida en todas las muestras fue superior a la del fármaco sin tratar. Tanto las metodologías de agitación como el tipo de secado aplicados en este estudio dieron como resultado la obtención de nanopartículas con diferentes características fisicoquímicas. A partir de todas las muestras que fueron secadas por liofilizado se obtuvieron partículas submicrómicas, con tamaños desde 49 a 394 nm, mientras que cuando el secado fue llevado a cabo en estufa las partículas exhibieron un tamaño micrométrico. En relación a la influencia del peso molecular del polietilenglicol, se demostró que el incremento del mismo dió como resultado la formación de nanopartículas de menor tamaño, y que a su vez aumentaba la solubilidad acuosa del fármaco. Además, el incremento del peso molecular del polietilenglicol se correlacionó de manera directamente proporcional con la velocidad de disolución de las correspondientes nanopartículas. Se observó que estos sistemas no interaccionaban significativamente con las proteínas del mucus y los ensayos de viabilidad celular indicaron que los mismos no presentaron citotoxicidad sobre células Caco-2. Finalmente se llevó a cabo un diseño de experimentos para optimizar la formulación de nanopartículas. En base a los resultados obtenidos previamente se implementaron dos etapas (screening y la fase de optimización). Las nanopartículas optimizadas de glibenclamida fueron preparadas empleando 400 mg de P-188, 8 mg de P-407, 200 mg de Eudragit RLPO e igual cantidad de polietilenglicol 6000, y agitación magnética. Este sistema, que brindó la mayor deseabilidad (0,83), alcanzó un rendimiento del 84 %, la eficacia de encapsulación fue del 94 %, el tamaño de partícula de 155 nm y una solubilidad acuosa del fármaco de 151,32 μg/ml. Por otro lado, se prepararon nanopartículas de benznidazol y poloxámero P-188, formuladas mediante un método de diseño con posterior optimización de experimentos. Estos sistemas fueron caracterizados in-vitro y se comprobó la eficacia antiparasitaria invivo en ratones. Además fueron formuladas nanocápsulas lipídicas de benznidazol mediante el método de inversión de fase, variando las cantidades de los mismos componentes con el objetivo de obtener sistemas con características diferentes. Finalmente se optimizó la cantidad y el tipo de aceite empleado para el desarrollo de los sistemas. Todas las nanocápsulas fueron caracterizadas in-vitro. En este trabajo se demostró que las condiciones para llevar a cabo la preparación de los nanosistemas de benznidazol y poloxámero P-188 fueron significativamente críticas en las características finales obtenidas. El tamaño de partícula se redujo, mientras que la cantidad de benznidazol nanocristalizado y la solubilidad acuosa del fármaco se incrementaron mediante el procedimiento de optimización. Las condiciones óptimas para la preparación de nanopartículas incluyeron el uso de una solución de benznidazol de 26 mg/ml, de 15 mg/ml de P-188 y el 30% de fase orgánica. Tanto la temperatura de cristalización como la velocidad de agitación no pudieron ser modeladas como factores significativos sobre las respuestas estudiadas. En las condiciones de deseabilidad (0,99), el 98 % de benznidazol fue nanocristalizado, el tamaño de partícula fue de 48 nm y la solubilidad acuosa de benznidazol de 3,75 mg/ml. Finalmente, este sistema optimizado se caracterizó in-vitro, demostrando un aumento significativo de la permeabilidad aparente de benznidazol. También se demostró que las nanopartículas de benznidazol formuladas a través de este proceso de optimización exhiben un notable efecto en la inhibición del crecimiento amastigotes de Trypanosoma cruzi en miocitos cardiacos primarios. Los ensayos in-vivo indicaron que todos los ratones sobrevivieron a la infección aguda con 15 dosis de 25 o 50 mg/kg/día de nanopartículas de benznidazol durante el ensayo. Estos hallazgos llevaron a la conclusión de que el tratamiento con nanopartículas de benznidazol es un enfoque muy conveniente, en diferentes dosis, para tratar con éxito la enfermedad de Chagas en un modelo experimental de infección aguda por Trypanosoma cruzi. Adicionalmente, estos sistemas se podrían dosificar en suspensiones acuosas para ser administrados a neonatos y niños, quienes hasta la actualidad no poseen medicación adecuada a su edad. También se formularon nanocápsulas lipídicas de benznidazol de diferentes tamaño, las que fueron caracterizadas fisicoquímicamente e in-vitro, demostrando no interaccionar con las proteínas del mucus y no generar cambios significativos en la activación del sistema del complemento. Además mantuvieron una alta sobrevida celular luego de 24 y 48 horas de tratamiento. Estos sistemas permitieron aumentar la permeabilidad aparente de fármaco hasta 10 veces, siendo controladas durante este proceso la integridad de la monocapa y la captación de las nanocápsulas lipídicas. En este sentido, se concluye que este tipo de nanocápsulas de BNZ representan una alternativa atractiva para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Por otro lado, ya que pueden obtenerse como una suspensión estable en medios acuosos, las nanocápsulas lipídicas podrían facilitar la administración de benznidazol en neonatos y niños. Por medio del procedimiento de nanocristalización controlada se formularon nanopartículas de praziquantel empleando P-188 y P-407 y alcohol poli(vinílico) como polímeros transportadores. El método de cristalización controlada se llevó a cabo empleando dos tipos de agitación: magnética (300 rpm) y homogeneizador (7000 rpm). Estos sistemas fueron evaluados in-vivo sobre el metabolismo de cisticercos de Taenia crassiceps en modelo animal. Por otro lado, se desarrollaron nanocápsulas lipídicas de praziquantel en base al método de inversión. Las mismas fueron caracterizadas fisicoquímicamente e in-vitro, y se evaluó su efecto frente a gusanos Schistosoma mansoni. Las nanopartículas de praziquantel preparadas con distintas proporciones de P-188, P- 407 y alcohol poli(vinílico), lograron un incremento en la solubilidad de praziquantel de hasta 19 veces con respecto a la solubilidad del fármaco de partida. La velocidad de disolución del fármaco se incrementó notablemente al estar nanoformulado. Esto podría deberse a que, como fue demostrado por ensayos de calorimetría diferencial de barrido y difracción de rayos X, las nanopartículas formuladas con alcohol poli(vinílico) reducen la cristalinidad del fármaco en una proporción mayor que los poloxámeros. Estas nanoformulaciones de praziquantel modificaron de manera considerable el metabolismo de cisticercos de Taenia crassiceps en modelo animal. También se formularon nanocápsulas lipídicas cargadas con praziquantel mediante el método de inversión de fase. Los resultados indicaron que las nanocápsulas sin fármaco y las de praziquantel exhiben un tamaño similar y cercano a 50 nm. El índice de polidispersidad en ambos casos fue menor o igual a 0,06, lo que sugiere una distribución de tamaño homogénea. Se observó una activación del sistema del complemento para las nanocápsulas lipídicas de praziquantel similar a la de las nanocápsulas sin fármacos, lo que podría indicar la presencia del fármaco en el interior de las cápsulas. La sobrevida de las células en presencia de las cápsulas (con y sin praziquantel) fue elevada tanto para el tratamiento de 24 como el de 48 horas. Se demostró actividad contra gusanos Schistosoma mansoni para las nanocápsulas de praziquantel mediante ensayos in-vitro. En este sentido, las nanocápsulas lipídicas cargadas con praziquantel representan una importante alternativa para una distribución eficiente de dicho agente antiparasitario. Por último, se formularon sistemas de fenbendazol. Se llevó a cabo un diseño de experimentos y su optimización para formular micropartículas de fenbendazol y alcohol poli(vinílico) empleando el secado por aspersión. Las partículas obtenidas fueron luego caracterizadas para comprobar la eficacia del diseño. Además se desarrollaron y caracterizaron nanocápsulas lipídicas y se evaluó su actividad antiparasitaria in-vitro frente a Echinococcus multilocularis. Se demostró que las condiciones en las que se lleva a cabo la preparación de micropartículas, empleando secado por aspersión influyen significativamente en las características finales de las mismas. Los sistemas microparticulados de fenbendazol presentaron buenos rendimientos, alta carga del fármaco en los sistemas y un incremento en la solubilidad acuosa del fenbendazol. La formulación de las micropartículas optimizadas se realizó a partir de 0,5 g de alcohol poli(vinílico), 50 ml de solución de Sipernat® (0,75 % p/v) y los parámetros de secado utilizados fueron con la bomba del aspersor en 12 % y la temperatura de entrada al sistema de secado en 131 ºC. El sistema con mayor deseabilidad (0,814) permitió obtener un rendimiento del 78 %, el porcentaje de fenbendazol en el sólido fue de 189 μg/mg de sólido y la solubilidad de fenbendazol en dicha formulación de 143,68 μg/ml. El análisis por medio de microscopía electrónica de barrido, calorimetría diferencial de barrido y difracción de rayos X confirmó la obtención de micropartículas esféricas regulares, en las cuales el fenbendazol presenta transiciones del estado cristalino al amorfo. Además, se demostró que el empleo de estas micropartículas de fenbendazol optimizadas permite el aumento significativo de la velocidad de disolución del fármaco. La incorporación de fenbendazol en nanocápsulas lipídicas fue llevada a cabo a partir del método de inversión de fase y las cápsulas obtenidas presentaron un tamaño relativamente homogéneo de 48 nm. Las nanocápsulas fueron estudiadas por microscopía electrónica de transmisión, observándose sistemas de estructura lisa y homogénea dónde se pudo confirmar la homogeneidad del tamaño de partícula. La eficiencia de encapsulación fue mayor al 89 %. Las nanocápsulas lipídicas mostraron no interaccionar con las proteínas del mucus, así como una baja influencia sobre la activación del sistema del complemento. Además fue evaluada su eficacia antiparasitaria in-vitro sobre Echinococcus multilocularis, llevando a cabo los ensayos de la enzima fosfoglucosa isomerasa y Alamar Blue. Se observa una mejora significativa en la actividad in-vitro contra el parásito de Echinococcus multilocularis cuando nanocápsulas lipídicas cargadas con fenbendazol fueron empleadas.