Caracterización bioquímica de la enzima fumarasa (FUM) de Arabidopsis thaliana. Análisis del rol de FUM en el metabolismo primario a través del estudio de plantas con actividad enzimática modificada

Algunas especies vegetales acumulan ácidos orgánicos en niveles comparables a los de los azúcares solubles y el almidón. Estos compuestos constituyen una fuente de carbono rápidamente metabolizable y conferirían una ventaja adaptativa bajo determinadas condiciones de crecimiento. En Arabidopsis thaliana los niveles de fumarato exhiben un perfil diurno/nocturno de acumulación/degradación, pudiendo superar los 30 μmol/mg PF (equivalente a 50 mM) al final del día. Esta singularidad de A. thaliana se debe a la presencia de una isoforma de localización citosólica de la enzima fumarasa (FUM2) codificada por un gen distinto al de la enzima mitocondrial (FUM1), involucrada en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (CAT). La caracterización fenotípica de plantas mutantes knock-out en el gen FUM2 (fum2.2) indica que la enzima es esencial para el rápido crecimiento de Arabidopsis en condiciones nutricionales de elevado N y para la aclimatación a las bajas temperaturas. Sin embargo, se desconoce el marco regulatorio que permitiría integrar las variaciones en los niveles de este intermediario del CAT con el concurso de una diversidad de procesos tendientes a mantener la fisiología general de Arabidopsis. El objetivo general del presente proyecto es identificar los compontes bioquímicos/moleculares subyacentes a la acumulación de fumarato en A. thaliana y su impacto en la fisiología de la planta. En la primera parte de la tesis se describen diversos análisis in silico y funcionales de los genes FUM1 y FUM2 de Arabidopsis. Las proteínas codificadas poseen una elevada identidad de secuencia y similares propiedades cinéticas. Sin embargo, los genes difieren en la composición y cantidad de elementos regulatorios presentes en las regiones promotoras que permiten explicar el patrón de acumulación diferencial de FUM1 y FUM2 bajo diferentes condiciones de crecimiento. El gen FUM2 genera dos transcriptos, FUM2.1 y FUM2b, el primero codifica para la enzima FUM2 funcional, mientras que el segundo retiene el último intrón y no es traducido, según resultados de expresión transiente. Variaciones en las condiciones nutricionales o ambientales provocan cambios en los niveles del transcripto FUM2b que son opuestos a los mostrados por FUM2.1. Se propone entonces, que FUM2b cumpliría un rol regulatorio de la actividad FUM2, actuando como una reserva para la generación de ARNm funcional frente a ciertos estímulos que invoquen su maduración y deriven en un rápido aumento de la actividad enzimática. Finalmente, la actividad enzimática de FUM1 y FUM2 se ve significativamente disminuida por condiciones oxidantes que conducen a la formación de un puente disulfuro intercatenario entre residuos de Cys ubicados en las cercanías del sitio activo. El estado reducido de estas Cys - invariablemente conservadas en las FUM de plantas- cumpliría un rol durante la catálisis, dado que su sustitución por Ser genera enzimas con valores de la constante catalítica (ks) que son hasta 6 veces menores al de la enzima parental. En la segunda parte de este trabajo se explora el rol del fumarato como una molécula cuyo perfil y nivel de acumulación constituirían una señal para la reprogramación de la expresión génica. Estudios previos indican que la línea mutante fum2.2 presenta niveles de fumarato marginales en relación a Col 0; y exhibe una respuesta transcripcional exagerada frente al frío que afecta su capacidad de aclimatación. Para abordar la hipótesis, se utilizó la técnica de infiltración con ácidos orgánicos de discos de hojas, evaluando las respuestas tempranas a la aclimatación al frío sobre la expresión de un grupo de genes. La técnica de infiltración permitió la acumulación de fumarato en fum2.2 a niveles comparables a los alcanzados por Col 0 en frío. Como resultado, en la mutante se restableció el patrón de expresión de más del 80% de los genes analizados cuyo perfil se hallaba alterado a bajas temperaturas. Este efecto transcripcional muestra una elevada especificad hacia la naturaleza del ácido y la especie vegetal, sugiriendo que el particular perfil de acumulación del fumarato en Arabidopsis constituiría una adaptación evolutiva relacionada a la mayor capacidad de aclimatación al frío que esta especie muestra en relación a otras. En humanos, el fumarato es considerado un oncometabolito en células cancerosas y participa en los mecanismos de reparación del ADN en animales y levaduras. En base a su mecanismo de acción en estos procesos, se propone que el fumarato reprogramaría la expresión génica en Arabidopsis redecorando el patrón de metilación de histonas. Algunos resultados de la presente tesis sugieren que, al igual que sus homólogos de animales y levaduras, FUM2 se distribuiría entre el citosol y el núcleo. La producción nuclear de fumarato modificaría la actividad de las enzimas demetilasas de histonas dependientes de α-cetoglutarato, sobre las cuales se ha probado que este ácido se comporta como un inhibidor competitivo en ensayos in vivo e in vitro, aumentando la deposición de histonas hipermetiladas. El trabajo de tesis finaliza con el estudio de las características de las semillas producidas por fum2.2. Bajo condiciones normales de crecimiento, la ausencia de actividad FUM2 no afecta la biomasa vegetativa. Sin embargo, las semillas maduras poseen un peso que es, en promedio, un 30 % menor al de las de Col 0; sin cambios estadísticamente significativos en el número de silicuas por planta y la cantidad de semillas por silicua. El fumarato es el principal ácido orgánico acumulado durante las primeras fases del desarrollo de la semilla, pero este ácido no fue detectado en la progenie de la línea fum2.2. Lo resultados sugieren, que la actividad FUM2 citosólica define algunas características del rendimiento de las semillas, controlando el tamaño y el contenido de agua de las mismas, así como también la proporción de proteínas y de ácidos grasos insaturados. Además, muestran una disminución del 16% de su capacidad germinativa y un fenotipo de ausencia de respuesta de inhibición de la extensión de la raíz primaria en medios de crecimiento sin N inorgánico. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis establecen un nuevo paradigma en torno al rol del fumarato en plantas. Los alcances de las fluctuaciones de los niveles de este ácido, reprogramando la expresión génica en la aclimatación al frío y delineando características de la progenie, abren un nuevo marco de estudio dirigido a evaluar la participación del fumarato en herencia transgeneracional del estado de vernalización, la embriogénesis y germinación. Estos estudios podrían contribuir a generar estrategias para prevenir algunos efectos del cambio climático que está afectando el rendimiento de especies de interés agronómico.