Regulación de la H+-ATPasa reversible mitocondrial por aniones : mecanismo de acción de sulfito

La ATPasa mitocondrial (F1Fo ATPasa/sintasa o H+-ATPasa mitocondrial) cataliza de manera reversible la síntesis de ATP acoplada a la translocación de protones a través de la membrana interna mitocondrial. Está constituida por un oligómero proteico hidrofóbico (Fo) firmemente integrado en la membrana interna mitocondrial y por un sector hidrosoluble (F1 o ATPasa soluble) que está unido a Fo. F1 está compuesta por cinco subunidades con la siguiente estequiometria: 33 y presenta seis sitios de unión para nucleótidos tres de ellos catalíticos y tres no catalíticos. La F1Fo-ATPasa unida a la membrana interna mitocondrial (SMP) es capaz de catalizar la síntesis y la hidrólisis de ATP, mientras que el sector hidrosoluble (F1), sólo es capaz de catalizar la hidrólisis de ATP. Un método sensible, rápido y sencillo que permita determinar la concentración de ATP y ADP presentes en el NAD(P)H o NAD(P) es necesario en estudios cinéticos de enzimas que utilizan ATP o ADP, especialmente cuando la actividad de las mismas es medida empleando sistemas acoplados basados en monitorear la oxidación de NAD(P)H o la reducción de NAD(P). Se diseñó y optimizó un método cinético, espectrofotométrico, basado en un ciclo catalítico de sustrato (hexoquinasa + piruvato quinasa), acoplado a lactato deshidrogenasa (LDH) para monitorear la velocidad del ciclo. Ésta depende, en ciertas condiciones, de manera lineal con las concentraciones de ADP y ATP. Se determinaron las concentraciones óptimas de glucosa (1 mM), PEP (2 mM) y MgCl2 (2 mM). Asimismo se determinó la cantidad de LDH necesaria para minimizar el tiempo de latencia (). La sensibilidad del método depende con la concentración de enzimas del ciclo. Cuando se utilizaron 20 UI/mL de ambas quinasas se determinó que la sensibilidad era igual a 0,611 ± 0,005 Abs min-1 nmol-1 de AT(D)P. El límite de detección fue igual 9,3 pmol y la reproducibilidad fue igual 5,6 %. El método permitió estimar que una preparación comercial de NADH contenía 0,85 ± 0,01 pmoles AD(T)P/nmol NADH. Asimismo fue posible estimar que existen trazas de ATP y ADP en otros componentes del medio de reacción, las que pueden ser eliminadas por pre-tratamiento del medio de reacción con apirasa. La H+-ATPasa es una enzima de comportamiento cinético complejo que, aun cuando se utiliza un sistema acoplado PK + LDH que mantiene constante la [ATP] y muy baja y constante la [ADP], muestra cinéticas de reacción bifásicas con el tiempo, comportamiento que es modificado por sulfito. Bajas concentraciones de sulfito linealizan el curso temporal de la reacción a bajas [ATP]. La unión del anión a un sitio no catalítico acelera la velocidad de disociación de ADP del complejo MgADP●F1 inactivo. En cambio a altas concentraciones de ATP sulfito induce una inhibición progresiva de la reacción de hidrólisis uniéndose a un sitio catalítico aumentando la velocidad de formación del complejo inactivo MgADP●F1. Es conocido desde hace más de 50 años que la actividad de la ATPasa mitocondrial es influenciada por la presencia de aniones. En el Área Biofísica de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas se han estudiado en detalle el efecto de bicarbonato y sulfato sobre las reacciones de hidrólisis y síntesis de ATP catalizadas por la ATPasa mitocondrial. Se realizaron estudios cinéticos del efecto de sulfito sobre la hidrólisis de ATP catalizada por SMP y F1 utilizando un amplio rango de concentraciones del anión y de ATP, los que permiten concluir que sulfito presenta un efecto dual: a concentraciones bajas se comporta como un activador no esencial y a concentraciones mayores como un inhibidor completo. La hidrólisis de ATP catalizada por el complejo de la ATPasa unido a membranas (SMP), fue aumentada por sulfito a concentraciones menores a 0,15 mM, mientras que concentraciones mayores la inhibieron. De manera similar a lo planteado para F1, estos resultados permiten postular que sulfito se une a dos sitios diferentes en la ATPasa mitocondrial. La unión a un sitio con alta afinidad (𝐾�����𝑑����� ≈ 10-3 M) activa la hidrólisis de ATP incrementando Vmáx y disminuyendo Km(ATP), mientras que la unión a un sitio con menor afinidad ( 𝐾�����𝑑����� ≈ 10-2 M) inhibe la hidrólisis de ATP disminuyendo Vmáx y Km(ATP) (inhibidor mixto lineal). Estudios empleando mezclas de sulfito y bicarbonato y sulfito y sulfato permiten sugerir que sulfito se une con alta afinidad a un sitio no catalítico (al igual que bicarbonato) y con baja afinidad a un sitio catalítico (al igual que sulfato). Sulfito 30 mM inhibe la síntesis de ATP acoplada a la oxidación de NADH por SMP. A dicha concentración el anión no afecta el transporte de electrones de NADH a oxígeno ni el grado de acoplamiento entre la cadena respiratoria y la ATP sintasa. De manera similar a lo observado al estudiar el efecto de sulfito sobre la actividad ATPásica, se observó un efecto dual de sulfito sobre la síntesis de ATP, estimulándola a bajas concentraciones e inhibiéndola a altas. Sulfito se comportó como un activador no esencial a [sulfito] < 2 mM, mientras que a mayores concentraciones el anión actuó como un inhibidor (mixto lineal respecto de ADP y de Pi) de la síntesis de ATP. Estudios utilizando mezclas de aniones permitieron concluir que sulfito (a bajas concentraciones) se comporta como ligando mutuamente excluyente de bicarbonato respecto de sus efectos sobre la síntesis de ATP. Por otra parte sulfito (a altas concentraciones) es un ligando mutuamente excluyente con sulfato. Fueron derivadas las ecuaciones correspondientes a las leyes cinéticas que caracterizan: la dependencia de la velocidad de hidrólisis de ATP con las [ATP] y de [sulfito] y la dependencia de la velocidad de síntesis de ATP con las [ADP], [Pi] y [sulfito], para un modelo de reacción consistente en la unión no mutuamente excluyente de sulfito a un sitio no catalítico (actuando como activador no esencial) y a un sitio catalítico (actuando como inhibidor mixto lineal). Las ecuaciones derivadas se corresponden con los comportamientos experimentalmente observados para el efecto de sulfito sobre la hidrólisis y síntesis de ATP.