(FSDPYECD) Material Didáctico
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Ítem Acceso Abierto Proteínas de unión a heparina en espermatozoides de verraco y su relación con la fecundidad(No disponible, 2010) Dapino, Dora; Cabada, Marcelo O.; Marini, Patricia E.1. Métodos para la evaluación de la integridad estructural del acrosoma El acrosoma almacena enzimas y proteínas cruciales para la interacción con el ovocito durante la fecundación, por lo que su evaluación resulta esencial. Las técnicas que evalúan el estado acrosomal (lectinas fluorescentes, contraste de fases, por ejemplo) no representan una alternativa accesible a los fines prácticos debido a que insumen mucho tiempo, su desarrollo es complejo o requieren de un equipo específico e insumos de alto costo que los hace inaplicables a un plan rutinario de control de calidad en los establecimientos que procesan semen porcino. Las técnicas que utilizan colorantes ofrecen una alternativa interesante tanto con fines de investigación, por su estabilidad, como con fines prácticos. Sin embargo, muy pocas de ellas han sido validadas con otras técnicas de evaluación estandarizadas. En este trabajo se evaluó la sensibilidad de la tinción Wells & Awa en detectar cambios paulatinos en la estructura acrosomal comparándola con técnicas estandarizadas como contraste de fases y Giemsa, mostrándose igualmente eficaz en dicha detección por acción de un inductor de reacción acrosómica como el ionóforo o por efecto de la conservación, lo que resulta de utilidad en los establecimientos que almacenan dosis seminales durante varios días. Las ventajas de esta técnica de tinción con respecto a otras, son la posibilidad de utilizar un simple microscopio de campo claro y la estabilidad de los preparados que hace que puedan ser guardados y observados más tarde. Por otro lado, su escaso tiempo de incubación y secado que favorece el mantenimiento de la integridad de las membranas, ofreciendo resultados más fieles y repetibles que otras tinciones de su misma clase. Estas características hacen que esta tinción posea la suficiente versatilidad para ser propuesta como de elección en los exámenes rutinarios de calidad seminal relacionados con la integridad estructural del acrosoma, tanto en la práctica diaria en los establecimientos productores de dosis de semen porcino destinadas a Inseminación Artificial, como en el laboratorio de Investigación. 2. Métodos de evaluación del estado fisiológico del espermatozoide En este trabajo se probaron las técnicas de CTC e Ionóforo de calcio A23187 con el fin de detectar, mediante técnicas microscópicas, las modificaciones estructurales de la membrana del espermatozoide como reflejo de cambios en su estado metabólico. Ambas técnicas mostraron ser eficientes en cuanto a su capacidad de diferenciar y mostrar la evolución del proceso de capacitación como consecuencia de la incubación de los espermatozoides de cerdo en medios capacitantes, obteniéndose valores de capacitación que coinciden con los habitualmente hallados en la especie porcina. 3. Rol de glucosaminoglicano heparina sobre la fisiología del espermatozoide porcino El efecto del glicosaminoglicano sulfatado heparina sobre la capacitación in vitro de espermatozoides porcinos fue evaluado mediante la observación de los patrones de fluorescencia con Clortetraciclina (CTC) y por la habilidad de los espermatozoides de experimentar una reacción acrosómica luego de la exposición a ionóforo de calcio. Los espermatozoides incubados durante 120 minutos en condiciones capacitantes (MC) suplementados con 10 μg/ml de heparina mostraron un incremento del número de espermatozoides capacitados (patrón B) y reaccionados sin afectarse su viabilidad, lo que determinó la elección de estas condiciones experimentales para los trabajos siguientes. Los espermatozoides fueron incubados en MC sin albúmina, calcio o bicarbonato o combinaciones en presencia de heparina. En los medios sin calcio o bicarbonato la capacitación fue basal no mostrando variaciones ante la presencia de heparina. En ausencia de albúmina, la presencia de calcio o bicarbonato estimularon la capacitación, que luego se incrementó con el agregado de heparina. Estos resultados sugieren que la heparina aumenta la capacitación in vitro de los espermatozoides de cerdo sólo en condiciones capacitantes. 4. Naturaleza de la interacción de la heparina con el espermatozoide Se evaluó la presencia, topología y dinámica de las proteínas de unión a heparina (HBP) en el espermatozoide de cerdo. La distribución de HBP se analizó mediante fraccionamiento subcelular utilizando heparina biotinilada seguida de una detección colorimétrica. Las HBP fueron detectadas como proteínas pertenecientes a la membrana periacrosomal del espermatozoide del tipo periféricas e integrales. Mediante microscopía de fluorescencia indirecta de espermatozoides incubados con heparina biotinilada se evidenció la unión de heparina al espermatozoide en diferentes estados fisiológicos. Se observaron dos patrones de fluorescencia diferentes (A y B), que probablemente se correspondan con los estados de espermatozoides no capacitados y capacitados, respectivamente; como se estableció mediante la inducción de la reacción acrosómica de espermatozides capacitados con ionóforo de calcio y la observación del aumento de la fosforilación de la proteína p32. En el patron A, predominante en muestras de espermatozoides no tratados, la fluorescencia se localizó en la región posacrosomal; en el patrón B, observado con mayor frecuencia en muestras de espermatozoides incubados en condiciones capacitantes, la fluorescencia ocupó la región acrosomal. Durante la incubación en medio capacitante (TALP), los espermatozoides mostrando el patrón B aumentaron paulatinamente comparados con espermatozoides no incubados o incubados en condiciones no capacitantes indicando que las modificaciones de los patrones de fluorescencia de HBP están probablemente relacionados con la capacitación. Cuando los espermatozoides fueron incubados con 100 μg/ml de heparina biotinilada en presencia o ausencia de heparina no marcada se observó que los sitios de unión a heparina se localizaron principalmente en la región acrosomal del espermatozoide de cerdo de manera específica y saturable. El efecto in vitro de la heparina observado en este trabajo indica que este glicosaminoglucano sulfatado, normalmente presente en el tracto reproductivo femenino podría cumplir un rol importante en el proceso de fecundación en porcinos. No se observaron diferencias cuando espermatozoides no tratados fueron permeabilizados con metanol o tritón antes de la tinción, lo que indica que las HBP se localizan en la superficie espermática. El efecto de la heparina sobre la fosforilación en tirosina de proteínas espermáticas por efecto de la capacitación fue también analizado encontrándose una disminución en la fosforilación de la proteína p32 en presencia de heparina. Esto sugiere que el incremento de la capacitación mediado por este glucosaminoglicano podría involucrar un proceso de señalización celular alternativo o ser el resultado de la pérdida de estas proteínas por efecto de la RA, hecho que se observa aumentado con el agregado de heparina en los medios de incubación. El hallazgo de que la heparina se une al espermatozoide en forma diferencial de acuerdo con su estado fisiológico es una nueva evidencia de la remodelación de la superficie de la membrana por efecto de la capacitación y podría proveer un método útil y relativamente simple para la evaluación in vitro de las modificaciones del estado fisiológico del espermatozoide porcino. 5. Caracterización del rol de la heparina en la unión del espermatozoide a la Zona Pelúcida. Con el fin de evidenciar el efecto de la heparina sobre la unión de los espermatozoides a ZP se utilizó el método del cubreobjetos cubierto de ZP. Al adicionar espermatozoides incubados bajo condiciones capacitantes y en presencia de heparina a los cubreobjetos, el número de espermatozoides unidos fue significativamente menor comparado con aquellos incubados en ausencia de heparina. En los cubreobjetos no tratados, el número de espermatozoides unidos fue mínimo y no varió significativamente a lo largo de todo el proceso de incubación, independientemente de la presencia de heparina. Este resultado se podría explicar considerando el hecho de que la ZP contiene cierto número de dominios polisulfatados que posiblemente competirían con la heparina. La mayoría de las HBP permanecen unidas al espermatozoide después de la capacitación, interviniendo algunas de ellas, como AWN-1 y DQH, en la unión primaria del espermatozoide a la ZP y es a estas proteínas a las que se uniría la heparina, hecho que sugiere que los glucosaminoglicanos de su tipo presentes en el tracto femenino podrían estar implicados en la preselección espermática y así contribuir a la prevención de la polispermia. 6. Las HBP como indicadoras de fecundidad en verracos En este trabajo se procedió a la detección de posibles diferencias en la unión a heparina de muestras de espermatozoides de animales con diferentes grados de fecundidad in vivo. Se procedió a clasificar inicialmente a un grupo de reproductores porcinos, cuyos parámetros de calidad seminal no mostraban diferencias en relación con los valores habituales de normalidad preestablecidos para la especie porcina, en dos grupos (I y II) en función de diferencias en cuanto a su Tasa de Parto (hembras paridas/hembras inseminadas), perteneciendo al grupo I los individuos con una tasa de fecundidad mayor o igual al 70 % y al grupo II, individuos con una tasa menor al 70 %. Muestras de semen de cada individuo fueron evaluadas mediante microscopía de fluorescencia indirecta utilizando la técnica de incubación de espermatozoides previamente incubados en condiciones capacitantes, con heparina biotinilada y revelado con streptavidina-FITC. Se encontraron diferencias significativas en cuanto al porcentaje de espermatozoides que muestran patrón B de fluorescencia en 2 animales pertenecientes al grupo II, los que muestran un porcentaje significativamente menor de fluorescencia en la región acrosomal en todos los tiempos de incubación testeados. Considerando que las HBP AWN-1, AQN-3 y DQH son retenidas en la membrana espermática luego de la capacitación interviniendo como receptores primarios en la unión ovocito-ZP, una disminución en la densidad de estas proteínas sobre la membrana del espermatozoide porcino podría estar reflejada en la disminución en el porcentaje de espermatozoides que unen heparina en la región acrosomal luego de capacitados (patrón B) observada en algunos individuos. En función de los valores de fecundidad inferiores observados para estos mismos animales este resultado estaría identificando, dentro de una población de reproductores aptos para la Inseminación Artificial, una subpoblación de individuos con menor capacidad fecundante (subfecundidad), característica que no se refleja en los análisis comúnmente utilizados para la evaluación de la calidad del semen porcino destinado a la Inseminación Artificial.Ítem Acceso Abierto Obtención de huevos de gallinas para consumo de calidad diferenciada, incrementando la proporción de ácidos grasos omega-3 y reduciendo el contenido de colesterol(No disponible, 2010) Antruejo, Alejandra Edit; Rosmini, Marcelo; Azcona, JorgeEl huevo de gallina es un producto de la actividad avícola cuya comercialización como tal, sin ningún tipo de procesamiento ulterior, le otorga la característica de “commodities”. La posibilidad de incorporar valor agregado a este producto permitiría incrementar su precio de venta, entrando en los circuitos de consumo de las denominadas "specialties". Muchos estudios científicos identificaron y caracterizaron los componentes del huevo demostrando que son muy importantes como fuente de nutrientes en la dieta humana. Numerosas actividades biológicas han sido asociadas a éstos, incluyendo actividades antibacterianas, antivirales, inmunomoduladoras y anticancerosas; indicando la importancia de los mismos en la salud humana, en la prevención y tratamiento de enfermedades. Entre dichos componentes, se encuentran las grasas con sus ácidos grasos, cumpliendo un rol de gran relevancia. Ya se conoce que, existe una asociación entre el consumo de ácidos grasos saturados y la incidencia de trastornos cardiovasculares en seres humanos; habiéndose reportado al ácido linolénico (C18:3 n-3) como indispensable para el desarrollo de cerebro en ratas; y que el consumo de ácidos grasos poliinsaturados omega-3, en particular el ácido eicosapentanoico (C20:5 n-3) y el docosahexaenoico (C22:6 n-3) han mostrado tener efectos benéficos sobre la salud humana. Se ha demostrado también que el consumo de huevos con mayor contenido en ácidos omega-3 permite reducir el riesgo de ateroesclerosis y ataques cardíacos, al tiempo de producir estímulos en el desarrollo neonatal del cerebro y la retina. Existe también evidencia que el desbalance en la relación omega-6/omega-3 es un factor de riesgo mayor para enfermedades cardiovasculares, cerebro-vasculares, cáncer y reacciones alérgicas. Los ácidos grasos omega-6 y omega-3 compiten por las mismas enzimas pero tienen diferentes roles biológicos, por lo que un correcto balance entre ellos es de considerable importancia. Las dietas occidentales son deficientes en omega-3 y altas en omega-6; entonces, se recomienda incrementar la ingesta de los primeros. Los animales no pueden sintetizar estos ácidos grasos, por lo que son considerados como esenciales y deben proporcionarse en la dieta. El objetivo de este trabajo fue modificar la composición lipídica de los huevos, mediante programas específicos de alimentación de las gallinas, lo que permitió incorporar valor agregado a los mismos favoreciendo una diferenciación en aspectos de calidad relacionados con la salud humana. En la sección Avicultura del INTA Pergamino se realizó una experiencia utilizando 480 pollas Shaver Brown alojadas a razón de dos aves por jaula. Cada tratamiento contó con 4 réplicas de 12 aves cada una distribuidos en bloques aleatorizados. La experiencia se inició a las 24 semanas de vida de las aves y tuvo una duración de 3 períodos de 28 días cada uno. Se evaluó el efecto del agregado a la dieta de diferentes fuentes de ácidos grasos omega-3 de origen vegetal, solas o en combinación con aceite de girasol alto oleico, sobre el contenido de ácidos grasos en huevos. Los tratamientos evaluados fueron los siguientes: 1. Lino semilla (15 %) + AGAO (1,5 %) * 2. Colza semilla (25 %) + AGAO (1,5 %) 3. Chía semilla (25 %) + AGAO (1,5 %) ** 4. Chía expeller (25 %) + AGAO (1,5 %) 5. Lino aceite (6%) 6. Chía aceite (6%) 7. Aceite comercial RCR 18% omega-3 (6%) *** 8. Control maíz -soja + AGAO (1,5%) 9. Control maíz -soja - Aceite Soja 10. Cobre tribásico **** En base a estas materias primas se formularon dietas diseñadas para producir huevos con niveles más altos de ácidos grasos poliinsaturados del tipo omega-3, mayor contenido de ácidos grasos monoinsaturados y con menor contenido de colesterol. El reemplazo de aceite de soja por aceite de girasol alto oleico, permitió aumentar los ácidos grasos monoinsaturados y disminuir los ácidos grasos poli insaturados, contribuyendo a lograr una mejor conservación en góndola. La inclusión de semilla de lino permitió aumentar la proporción de ácidos grasos omega-3 y disminuir la relación omega-6 / omega-3 por debajo de 4, nivel recomendado desde un punto de vista médico. Con la inclusión de cobre tribásico se pretendió reducir el nivel de colesterol. De esta manera, el desarrollo de huevos ricos en omega-3 cubriría la creciente demanda de los consumidores, que buscan alimentos que ofrezcan mayor protección para la salud y beneficios terapéuticos. Estos productos, diferenciados por su mejor calidad nutricional y con ventajas para la salud humana, tienen un valor comercial superior a los tradicionales, brindando oportunidades de mercado a las empresas que los produzcan. En el presente estudio además del perfil de ácidos grasos en materias primas y huevos, se midieron variables relacionadas a la respuesta zootécnica: postura (%/ ave/ día); consumo de alimento (promedio de cada período de 28 días); peso del huevo (g) tomando una muestra al finalizar cada período; y la mortalidad. Con esta información se calculó la masa de huevo/ ave/ día y la conversión alimenticia. También se estudió la calidad interna (Unidades Haugh) y externa (mg/cm2 de cáscara) del huevo. En general, la respuesta zootécnica obtenida con las distintas dietas fue superior a la que se registra en condiciones prácticas, con niveles de postura superiores al 97%. Este resultado brinda confiabilidad respecto al aporte de nutrientes de las distintas dietas. No obstante, hubo algunas diferencias respecto del control. Con semillas de lino, colza y chía se observó un aumento en la conversión por kg de huevo. Con los distintos aceites no se observaron diferencias respecto del control. La calidad interna y externa del huevo disminuyó con la edad del ave sin que se observen efectos adversos de los tratamientos en calidad interna. La calidad de cáscara se vio afectada en el caso de los tratamientos con semillas de colza, chía y expeller de chía. Con los niveles más altos de inclusión de las distintas fuentes de omega-3 fue posible modificar el perfil de ácidos grasos en huevo, lográndose un aumento en el contenido de omega-3 de hasta 8 veces respecto del control, utilizando semilla de chía (1,4% a 11.3%). Con la combinación aceite de girasol alto oleico y semilla de colza, el contenido de ácidos grasos monoinsaturados se incrementó 1,4 veces (36.6% a 49.9%). Por otra parte se logró una reducción de la relación omega-6/omega-3 (de 9.36 a 1.56) al incluir semilla de chía. El uso de cobre tribásico permitió una leve disminución (no significativa) del nivel de colesterol.Ítem Acceso Abierto Endometritis subclínica en vacas lecheras: diagnostico, tratamiento e incidencia productiva y reproductiva(No disponible, 2012-05) Rinaudo, Agustín; Marini, Pablo Roberto; Bernardi, Sandra FabianaLas empresas ganaderas de producción láctea requieren que sus vacas se preñen en el menor tiempo posible para lograr la mayor eficiencia reproductiva y productiva de sus rodeos. Las patologías reproductivas repercuten de manera negativa sobre esa performance, tan ansiada por los productores lácteos. Una de las entidades mórbidas con asiento en la mucosa uterina es la endometritis subclínica, que se caracteriza por la presencia de polimorfonucleares neutrófilos en la luz uterina sin descargas mucopurulentas apreciables. La identificación de dicha patología toma importancia en el período posparto para una pronta detección de la misma y evaluación de los pasos a seguir sobre la misma. El diagnóstico de endometritis subclínica se realiza mediante una técnica citológica, de rápida y fácil ejecución, conocida como cytobrush, a través de la cual se pueden obtener datos confiables del estado de la mucosa uterina. El objetivo de esta tesis fue analizar si la endometritis subclínica, durante el posparto, afectaba la eficiencia productiva y reproductiva de la vaca lechera en establecimientos del sur de la provincia de Santa Fe. Los resultados obtenidos mostraron que la endometritis subclínica en las vacas estudiadas afectaron de manera significativa (p<0,05) la performance reproductiva de las mismas, las vacas con endometritis subclínica necesitaron 4 servicios para lograr la preñez en contraposición a los 2 que requirieron las vacas sanas (p<0,0001). Por ende las vacas enfermas tuvieron mayor cantidad de días de intervalo parto concepción (166) que las vacas sin endometritis subclínica (113) (p=0,0004). Por otro lado se observó que la presencia de endometritis subclínica no se ve influenciada por la mejor o peor condición corporal de la vaca, por el número de partos, y por la producción láctea total de la vaca de manera significativa (p>0,05). El sistema de producción mostró una predisposición a una mayor prevalencia de endometritis subclínica sobre el final del período de espera voluntario (38-56 días postparto) en el sistema estabulado o Free Stall (20 %), que en el sistema a pastoreo con suplementación (14,9 %). (p<0,05). El uso de análogos de la prostaglandina F2α durante el posparto, mostró que su uso si bien disminuye la presencia de endometritis subclínica no lo hace de manera estadísticamente significativa (p>0,05). Se concluye que la endometritis subclínica es una entidad que repercute en la eficiencia reproductiva de los establecimientos lecheros analizados, es por esta razón que se considera de sumo interés continuar con su estudio, aumentando el número de vacas y establecimientos para la confirmación de las consecuencias reproductivas y por ende también productivas que podrían acarrear los rodeos de la cuenca lechera sur de la provincia de Santa Fe.