Examinando por Autor "Uttaro, Antonio Domingo"
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Ítem Acceso Abierto A novel Tetrahymena thermophila sterol C-22 desaturase belongs to the fatty acid hydroxylase/desaturase superfamily(Elsevier, 2022-10) Sanchez Granel, María L.; Siburu, Nicolás G.; Fricska, Annamária; Maldonado, Lucas L.; Gargiulo, Laura B.; Nudel, Clara B.; Uttaro, Antonio Domingo; Nusblat, Alejandro D.Ítem Acceso Abierto Aspectos fisiológicos del metabolismo de esteroles en Tetrahymena thermophila(2019) Hernández, Josefina; Uttaro, Antonio DomingoTetrahymena thermophila es un ciliado de vida libre, aerobio y fagótrofo, que habita en fuentes de agua dulce de clima templado. La cubierta de cilias que posee en la totalidad de su superficie le permite movilizarse y alimentarse, y una compleja estructura interna le confiere resistencia y flexibilidad. Las membranas de T. thermophila poseen un hopanoide denominado tetrahymanol en lugar de los esteroles conocidos en otros eucariotas; sin embargo, cuando encuentra esteroles en su medio de crecimiento, los incorpora y los modifica tanto por desetilación -en el caso de ser fitoesteroles- como por adición de dobles enlaces en posiciones 5(6), 7(8) y 22(23). El compuesto final tri-insaturado, llamado 7,22-bis dehidrocolesterol, eventualmente reemplaza al tetrahymanol en la membrana. En este trabajo de tesis, particularmente se abordaron los mecanismos involucrados en la internalización de esteroles, y en las vías de señalización que conducen al cambio en la expresión de las enzimas involucradas. Por medio de videos digitales de alta resolución se comprobó que las células de T. thermophila suplementadas con colesterol aumentan inmediatamente la velocidad promedio de nado, de tipo lineal. Este efecto es característico de quimio-atrayentes, siendo la primera vez que se demuestra un comportamiento similar frente a esteroles. También se observó un mayor número de células en el estado estacionario de cultivos crecidos con colesterol, indicando un posible efecto mitogénico. Evidenciamos una modulación transcripcional generalizada en cultivos de T. thermophila suplementados con colesterol. Analizando el transcriptoma de estas células, obtenido por RNAseq, identificamos 177 genes inducidos y 179 genes reprimidos significativamente (genes diferencialmente expresados, o GDE). Sólo tres de los cuatro genes que codifican para las desaturasas de esteroles se encuentran inducidos. La mayor parte de los genes involucrados en la síntesis de tetrahymanol se encuentran reprimidos, confirmando que dicha síntesis es regulada principalmente a nivel transcripcional. Entre otros genes identificados figuran algunos presumiblemente involucrados en el transporte de esteroles y en mecanismos de señalización celular. Los resultados de RNAseq se validaron por medio de la técnica RT-qPCR. El patrón de expresión de los GDE seleccionados es consistente entre ambas metodologías, demostrando la confiabilidad de los datos de RNAseq. La técnica de RT-qPCR, además, fue utilizada como una herramienta para evaluar los cambios a nivel transcripcional de cultivos de T. thermophila sometidos a diferentes tratamientos, utilizando algunos de los GDE como “reporteros” de inducción/represión. En primera instancia, se ensayaron compuestos comerciales conocidos por afectar vías de señalización canónicas. La intención fue encontrar paralelismos en su accionar que pudieran dar un indicio sobre las vías de traducción de señales gatilladas por colesterol. De los numerosos compuestos probados, sólo cuatro ejercieron un efecto significativo, antagónico al colesterol. En otros modelos celulares, estas drogas inhiben la acción de fosfolipasas y/o kinasas; sin embargo, en T. thermophila no hemos observado diferencias en los patrones de fosforilación de proteínas producidos por colesterol, droga, o una combinación de ambos. Sus blancos son, entonces, diferentes a los reportados para los modelos animales. En todos los casos, el efecto sobre el gen reportero de represión fue total, mientras que sobre el de inducción fue parcial, lo que da cuenta de la existencia de al menos dos vías de señalización diferentes para estos grupos de genes. Las siguientes preguntas por resolver fueron cómo ocurre la internalización y compartimentalización de los esteroles, y cómo estos procesos se asocian a las señales que desencadenan la regulación transcripcional. Un trabajo reportado por otros autores utilizando la cepa deficiente en fagocitosis T. thermophila II8G-IA sugería que la incorporación de esteroles ocurre únicamente por fagocitosis. Se utilizó la misma mutante en comparación con la cepa salvaje para (a) observar la actividad transcripcional frente a colesterol, (b) detectar la producción de esteroles modificados, y (c) describir las vías de incorporación de esteroles. Empleamos para algunos de estos fines Citocalasina D (CytD), inhibidor de la endocitosis dependiente de actina, y U18666A, inhibidor de la proteína NPC1, encargada del egreso de colesterol desde los endolisosomas hacia otras organelas, como el retículo endoplasmático (RE). Comprobamos así que existen dos vías de incorporación, ambas dependientes de actina: una fagocítica, en la cual la acumulación de colesterol es masiva y a cortos tiempos, y otra endocítica (evidenciable en la mutante), más lenta, aunque sostenida en el tiempo. En contraste con la cepa salvaje, en la cepa mutante II8G-IA el colesterol no es modificado hacia los derivados insaturados. En los perfiles de lípidos de ambas cepas incubadas con 14C-colesterol se distinguen bandas de ésteres de esteroles, evidenciando su pasaje por RE -donde reside la enzima responsable de la esterificación, la acil-CoA transferasa-. No se observan esteroles acilados cuando se agrega U18666A al medio; este compuesto inhibiría a una proteína similar en función a NPC1 de este ciliado, impidiendo la salida de colesterol desde los endolisosomas, y consecuentemente, su llegada al RE. En la cepa mutante, sólo el grupo de GDE inducibles responden a colesterol. Por ende, el ingreso del esterol por fagocitosis es clave para la represión de genes. Esto es coherente con la existencia de dos vías de señalización distintas planteadas anteriormente. Tanto CytD como U18666A ejercen un efecto antagónico al colesterol sobre los GDE de ambas cepas. Las señales por colesterol se generarían entonces en compartimentos intracelulares, y no en la membrana plasmática, de forma similar a lo que ocurre en eucariotas superiores.Ítem Acceso Abierto Biosíntesis de ácido lipoico y proteínas lipoiladas en tripanosomátidos(2017-03-31) Lambruschi, Daniel Andrés; Uttaro, Antonio DomingoEl tratamiento de las infecciones por tripanosomas depende de un pequeño número de drogas que tienen limitada eficacia y pueden causar severos efectos secundarios. El ácido lipoico (AL) es una molécula esencial para la viabilidad de la mayoría de los organismos procariotas y eucariotas de metabolismo aeróbico. No sólo por su participación como cofactor de complejos multienzimáticos que intervienen en la respiración celular y el metabolismo central sino también por su papel como regulador redox. Es por ello que se plantearon como objetivos principales de esta tesis: i) validar el metabolismo de lipoilación de proteínas en Trypanosoma cruzi como potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico, y ii) identificar y caracterizar las enzimas involucradas en dicho metabolismo. Dado que existen antecedentes en la utilización de análogos estructurales de AL como inhibidores del crecimiento de distintos microorganismos, incluyendo parásitos como Plasmodium falciparum, se decidió ensayar el efecto del inhibidor más conocido, 8-bromo-octanoato (BrO), sobre cultivos de T. cruzi epimastigotes de las cepas CL Brener y Dm28c. Se realizaron curvas de inhibición a distintas concentraciones que evidenciaron un efecto letal sobre los parásitos. No obstante, las concentraciones requeridas fueron altas como para ser relevantes en términos quimioterapéuticos (EC50 = 0,591 ± 0,190 mM para CL Brener y EC50 = 0,829 ± 0,033 mM para Dm28c). Tras demostrar que por la falta de transportadores específicos el BrO no era incorporado eficientemente por los parásitos, se sintetizó un derivado metil éster –metil-8-bromo-octanoato (MBrO)- presumiblemente más permeable a la membrana celular y se ensayaron nuevas curvas de inhibición mejorándose la efectividad de la droga en hasta un orden de magnitud (EC50 = 66,18 ± 10,40 μM y 62,17 ± 7,46 μM para una y otra cepa). Por otro lado, se estudió si este efecto letal en el crecimiento se debía efectivamente a la inhibición del metabolismo de lipoilación. Mediante la realización de western blots anti-lipoamida se pudo apreciar cómo el tratamiento con ambas drogas disminuía o suprimía por completo la lipoilación de proteínas. Más aún, observamos que la señal de una de las proteínas lipoiladas, la subunidad E2 (E2p) del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH), mostraba una intensidad muy baja respecto del resto, razón por la cual nos preguntamos –teniendo en cuenta las funciones metabólicas de cada complejo lipoilado- si las condiciones de cultivo estarían influyendo. Efectivamente, al crecer cultivos en condiciones de baja glucosa (de una concentración diez veces menor a la utilizada en el medio LIT convencional) y realizar extractos mitocondriales y nuevos western blots, la señal de E2p aumentó notoriamente. Por último, demostramos que las actividades α-oxoácido deshidrogenasas de los complejos lipoilados desaparecían en extractos de cultivos tratados con MBrO. Adicionalmente, vimos que la actividad PDH aumentó hasta cinco veces en condiciones de baja glucosa. En su conjunto, estos resultados nos permitieron validar el metabolismo de lipoilación de proteínas de T. cruzi como un potencial blanco quimioterapéutico, que además sería de efecto altamente pleiotrópico. En segundo lugar, tras observar que BrO (análogo de AL) y octanoato libre (precursor de AL) son incorporados pobremente al interior celular, aportamos nuevas evidencias a favor de la ausencia de la vía de salvataje de AL en tripanosomátidos, en concordancia con otras evidencias reportadas en T. brucei por otros laboratorios. Estos resultados plantearon la necesidad de profundizar nuestro conocimiento sobre los mecanismos involucrados en el metabolismo de lipoilación del parásito, los cuales deben ser lo suficientemente divergentes en términos evolutivos de aquellos presentes en el ser humano para poder diseñar fármacos inocuos para nuestra salud. Por ello se identificaron las enzimas que participan en la síntesis de novo de AL y se caracterizaron dos de ellas. En este caso, se trabajó con los genes de Trypanosoma brucei dado que el genoma de T. cruzi fue realizado sobre la cepa CL Brener, un híbrido de poliploidía incierta y especie que se caracteriza por poseer múltiples alelos. En primer lugar, mediante ensayos de reversión de fenotipo de levaduras mutantes lip2, incapaces de sintetizar AL por falta de una octanoiltransferasa, se demostró que el gen Tb927.11.9390 (TblipT) codifica una octanoiltransferasa específica para la proteína H y la subunidad E2p. Se ensayaron distintos medios de cultivo: YPG, YNBDGly, YPS e YPE (suplementado con AL u octanoato 50 μM, y sin suplementar), ajustándose a nuestra hipótesis el comportamiento de las cepas complementadas con el gen de interés, en todos los casos y según el medio en cuestión. Estos resultados fueron revalidados mediante western blots anti-lipoamida, tanto en extractos de proteínas de levaduras mutantes como de Escherichia coli doble mutantes (cepa TM136), ambas expresando el gen de T. brucei. Cabe destacar que este último caso nos permitió dilucidar por completo la especificidad de TbLipT, dado que en las levaduras mutantes lip2, la actividad de una de las enzimas funcionales endógenas de la vía de síntesis de AL, Lip3, enmascaraba los efectos de nuestra enzima en estudio, no así en el caso de TM136, donde pudimos determinar la capacidad de esta enzima de acilar la subunidad E2p. Se realizó un estudio análogo al de TblipT con el gen Tb927.8.630 (TblipL), de particular importancia debido a que como hemos indicado, los tripanosomas carecen de la vía de salvataje de AL. Curiosamente, TblipL posee homología con lipoato proteína ligasas, enzimas que intervienen en dicha vía. No obstante, estas enzimas pertenecen a una superfamilia caracterizada por conservar cierto grado de homología secuencial y estructural pero de funciones diversas, incluyendo octanoiltransferasas, amidotransferasas, octanoil-CoA:proteína transferasas e incluso biotina proteína ligasas. Se realizaron ensayos de reversión de fenotipo de la mutante de levadura lip3, carente de una enzima con aparente actividad amidotransferasa u octanoil-CoA:proteína transferasa. La complementación funcional provocada por TbLipL en los medios YNBDGly e YPE (suplementado y sin suplementar) indicaría que se trata también de una acil transferasa, pero específica para E2k, subunidad del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH). Ensayos de western blots anti-lipoamida realizados a partir de extractos mitocondriales de levaduras mutantes lip3 complementadas con TblipL mostraron la aparición de una banda correspondiente a E2k, revalidando los resultados y conclusiones. Proponemos que los tripanosomas carecen de una vía de salvataje de AL libre y lipoilan sus proteínas mediante la síntesis de novo. En esta vía, una octanoiltransferasa LipT transfiere residuos octanoilos desde octanoil-ACP a la proteína H del complejo de clivaje de glicina y a la subunidad E2 de PDH. Una ligasa/amidotransferasa (LipL) octanoila las subunidades E2 de KGDH y presumiblemente -dado que no está presente en levaduras- del complejo deshidrogenasa de α-cetoácido de cadena ramificada, a partir de un dador de octanoilos aún no caracterizado. Una tercera enzima identificada bioinformáticamente, LipS, de actividad lipoato sintasa y altamente conservada, catalizaría la inserción de dos átomos de azufre sobre los grupos octanoilos, ya incorporados a H, E2k y E2p, convirtiéndolas en las holoproteínas lipoiladas. La vía descripta, además, ha sido validada como un potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico.Ítem Acceso Abierto Functional characterization of the first lipoyl-relay pathwayfrom a parasitic protozoan(Wiley, 2022-06) Scattolini, Albertina; Lavatelli, Antonela; Vacchina, Paola; Lambruschi, Daniel Andrés; Mansilla, María Cecilia; Uttaro, Antonio Domingo; https://orcid.org/0000-0001-7421-2039; https://orcid.org/0000-0001-7164-213X; https://orcid.org/0000-0001-5866-3657; https://orcid.org/0000-0001-5787-5711; https://orcid.org/0000-0002-1444-8661Lipoic acid (LA) is a sulfur-containing cofactor covalently attached to key enzymes of central metabolism in prokaryotes and eukaryotes. LA can be acquired by scavenging, mediated by a lipoate ligase, or de novo synthesized by a pathway requiring an octanoyltransferase and a lipoate synthase. A more complex pathway, referred to as “lipoyl-relay”, requires two additional proteins, GcvH, the glycine cleavage system H subunit, and an amidotransferase. This route was described so far in Bacillus subtilis and related Gram-positive bacteria, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, and Caenorhabditis elegans. Using collections of S. cerevisiae and B. subtilis mutants, defective in LA metabolism, we gathered evidence that allows us to propose for the first time that lipoyl-relay pathways are also present in parasitic protozoa. By a reverse genetic approach, we assigned octanoyltransferase and amidotransferase activity to the products of Tb927.11.9390 (TblipT) and Tb927.8.630 (TblipL) genes of Trypanosoma brucei, respectively. The B. subtilis model allowed us to identify the parasite amidotransferase as the target of lipoate analogs like 8-bromo-octanoic acid, explaining the complete loss of protein lipoylation and growth impairment caused by this compound in T. cruzi. This model could be instrumental for the screening of selective and more efficient chemotherapies against trypanosomiases.Ítem Acceso Abierto Phagocytic and pinocytic uptake of cholesterol in Tetrahymena thermophila impact differently on gene regulation for sterol homeostasis(Nature Research, 2021-04-27) Hernández, Josefina; Gabrielli, Matías; Costa, Joaquín; Uttaro, Antonio DomingoÍtem Acceso Abierto Sterol metabolism in the filasterean Capsaspora owczarzaki has features that resemble both fungi and animals(The Royal Society, 2016-07-01) Najle, Sebastián R.; Molina, María Celeste; Ruiz-Trillo, Iñaki; Uttaro, Antonio DomingoÍtem Acceso Abierto Structural determinant of functionality in acyl lipid desaturases(Elsevier, 2018-10) Sastre, Diego Emiliano; Saita, Emilio Adolfo; Uttaro, Antonio Domingo; De Mendoza, Diego; Altabe, Silvia GracielaLittle is known about the structure-function relationship of membrane-bound lipid desaturases. Using a domain-swapping strategy, we found that the N terminus (comprising the two first transmembrane segments) region of Bacillus cereus DesA desaturase improves Bacillus subtilis Des activity. In addition, the replacement of the first two transmembrane domains from Bacillus licheniformis inactive open reading frame (ORF) BL02692 with the corresponding domain from DesA was sufficient to resurrect this enzyme. Unexpectedly, we were able to restore the activity of ORF BL02692 with a single substitution (Cys40Tyr) of a cysteine localized in the first transmembrane domain close to the lipidwater interface. Substitution of eight residues (Gly90, Trp104, Lys172, His228, Pro257, Leu275, Tyr282, and Leu284) by site-directed mutagenesis produced inactive variants of DesA. Homology modeling of DesA revealed that His228 is part of the metal binding center, together with the canonical His boxes. Trp104 shapes the hydrophobic tunnel, whereas Gly90 and Lys172 are probably involved in substrate binding/recognition. Pro257, Leu275, Tyr282, and Leu284 might be relevant for the structural arrangement of the active site or interaction with electron donors. This study reveals the role of the N-terminal region of 5 phospholipid desaturases and the individual residues necessary for the activity of this class of enzymes.