Examinando por Autor "Podio, Maricel"

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    A reference floral transcriptome of sexual and apomictic Paspalum notatum
    (BMC, 2017-04-21) Ortiz, Juan Pablo Amelio; Revale, Santiago; Siena, Lorena Adelina; Podio, Maricel; Delgado, Luciana; Stein, Juliana; Leblanc, Olivier; Pessino, Silvina Claudia
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    Análisis de Conservación y Microsintenía de la Región Genómica Responsable de la Apomixis (acr) en Paspalum notatum
    (FCA-UNR, 2021-11-13) Spoto, Nicolás Leandro; Ortiz, Juan Pablo Amelio; Stein, Juliana; Podio, Maricel
    La apomixis es una forma de reproducción clonal por semillas que origina progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Este carácter fija naturalmente cualquier combinanción genética y por lo tanto es de gran interés para el mejoramiento. La apomixis está ampliamente difundida en las angiospermas, pero no se encuentra en las especies de gran cultivo. Solamente algunos géneros de gramíneas forrajeras subtropicales, el mango y las fresas presentan naturalmente este tipo de reproducción. La manipulación del carácter y su transferencia a los cultivos mayores puede tener un gran impacto en la agriculura. En la apomixis de tipo gametofítica, los embriones maternos se desarrollan por partenogénesis (sin fecundación) a partir de sacos embrionarios no reducidos (sea) derivados de células somáticas del óvulo (aposporía), o de la propia célula madre de la megáspora (diplosporía) luego de una falla en la meiosis. Varios autores sugieren que la apomixis puede derivar de cambios genéticos o epigenéticos de vías claves de la sexualidad. Paspalum notatum es una gramínea rizomatosa perenne que forma complejos agámicos y multiploides en los cuales el citotipo diploide se reproduce sexualmente, mientras que el tetraploide se reproduce por apomixis de tipo apospórica. La apomixis está controlada por un locus complejo, localizado en una región genómica de aproximadamente 36 Mpb, denominado acr (por Apospory Controlling Region), que presenta una segregación distorsionada, ausencia de recombinación y una alta metilación de citosinas. Este segmento cromosómico, está asociado (presenta sintenía) a regiones de los cromosomas 2 y 12 de arroz (Os2 y Os12), pero su constitución génica y estructural es aún desconocida. El objetivo de este trabajo fue determinar la conservación de los segmentos cromosómicos de arroz asociados al acr en diferentes especies de gramíneas, determinar su contenido génico, analizar los posibles patrones de expresión de los genes presentes durante el desarrollo reproductivo e identificar regiones genómicas asociadas al acr utilizando un borrador del genoma de un citotipo diploide de P. notatum. XIII Resumen Como material vegetal se utilizaron los genotipos tetraploides Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico), una población F1 de 18 híbridos derivada del cruzamiento entre ellos y ocho genotipos apomícticos. La caracterización del modo reproductivo del material vegetal fue realizada mediante observaciones citoembriológicas de ovarios clarificados en estado de antesis y por análisis moleculares utilizando el marcador scar spna2, que se encuentra completamente ligado a la apomixis en la especie. Ambos estudios mostraron resultados concordantes en los individuos ensayados a excepción del genotipo Q3664 (un genotipo apomíctico facultativo), el cual presentó sea y ausencia del marcador. Este resultado indicaría que Q3664 sería un recombinante para el marcador utilizado y el acr, en esa región. El genotipo presenta un bajo porcentaje de expresión de la aposporía (11 %) con respecto a los genotipos apomícticos obligados (65 a 89 %) que sí contienen el marcador. A fin de validar la asociación del cromosoma Os2 con el acr, se identificaron transcriptos de P. notatum con homología al marcador de rflp C932 (que mapea en dicha región de arroz y que codifica para un gen ppi) expresados en los transcriptomas reproductivos sexual y apomíctico. Como resultado se obtuvieron cinco secuencias homólogas a partir del trascriptoma sexual y tres del apomíctico, respectivamente. Mientras los cinco transcriptos sexuales fueron semejantes al gen de arroz, los transcriptos apomícticos resultaron variables; una de las formas mostró semejanzas con el gen funcional, otra resultó un pseudogen sin aparente capacidad codificante, y el tercero resultó un transcripto quimérico, codificante para los dominios ppi y dnaj. El mapeo de las secuencias genómicas de cada transcripto en la población F1 segregante, demostró que la forma quimérica del gen segrega completamente ligada al carácter apomixis. Este resultado confirmó la asociación del segmento del cromosoma Os2 con el carácter y determinó que la forma quimérica es la que se encuentra en el acr. Los estudios de conservación de los segmentos de arroz demostraron que las regiones de los cromosomas Os2 y Os12 sinténicas al acr de P. notatum presentan una alta conservación en el contenido y orden génico respecto a seis de las siete especies del género Oryza estudiadas (O. sativa grupo Indica, O. barthii, O. brachyantha, O. glaberrima, O. glumipatula, O. punctata). Sin embargo, para el caso de Sorghum bicolor, se identificó una inversión de 6 Mpb y en Oryza nivara, se detectaron bloques de sintenía translocados entre los cromosomas homólogos al Os2 y Os12. A fin de analizar los posibles patrones de expresión de los genes presentes en los segmentos de arroz asociados al acr se estudió un transcriptoma floral por estadios del desarrollo reproductivo apomíctico y sexual de P. notatum. Este estudio reveló que la mayor parte de los transcriptos codificantes diferenciales están sobrexpresados en el XIV Resumen genotipo apomíctico. Además, se observó que en los cromosomas Os2 y Os12 se localiza una proporción mayor de transcriptos sobrexpresados del genotipo apomíctico que en el resto de los cromosomas. Un análisis similar mostró que el Os12 presenta la mayor proporción de transcriptos no codificantes sobrexpresados en el genotipo apomíctico. A partir de la disponibilidad de un borrador del genoma de un citotipo diploide de P. notatum, se detectaron scaffolds asociados al acr mediante el mapeo de 17 secuencias que cosegregan con la apomixis. Este análisis identificó 10 scaffolds que fueron caracterizados por su contenido génico. Las secuencias identificadas determinaron que presentan regiones sinténicas a las regiones cromosómicas de arroz asociadas al acr, presentando además una alta conservación en el contenido y orden génico. Estos resultados indican que el genoma diploide contiene, al menos parcialmente, el acr presente en los citotipos tetraploides. Uno de los scaffolds estudiados (utg001125l) contiene genes homólogos a genes de arroz localizados en las regiones sinténicas de los cromosomas Os2 y Os12, lo cual podría representar el sitio de yuxtaposición de la sintenía mixta del acr. El escrutinio detallado de las secuencias de arroz identificadas en cada uno de los análisis nos permitió identificar una lista de 100 candidatos para futuros estudios referidos a la apomixis entre los cuales los genes ppi, huellenlos, exs, ttg1 y mt-a70 aparecen como los más relevantes.
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    Estudios citogenéticos en citotipos apomícticos y sexuales de paspalum notatum y caracterización molecular de secuencias asociadas a la aposporía
    (FCA-UNR, 2012) Podio, Maricel; Ortiz, Juan Pablo
    Paspalum notatum Flügge es una gramínea rizomatosa perenne ampliamente difundida en las regiones tropicales y subtropicales de Sudamérica. Las razas tetraploides naturales de esta especie se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La aposporía (un componente de la apomixis apospórica) en P. notatum es controlada por un locus único (denominado ACL) que presenta segregación distorsionada y supresión de la recombinación. La presencia de inversiones u otras alteraciones cromosómicas fueron propuestas para explicar el tipo de herencia observado para la aposporía. La determinación de la estructura cromosómica que contiene al ACL puede aportar conocimiento sobre la transmisión del carácter a la progenie y contribuir a la identificación de secuencias codificantes asociadas con su expresión. Por otro lado, varios marcadores moleculares completamente ligados a la aposporía y transcriptos de ARNm diferencialmente expresados en inflorescencias de plantas apomícticas y sexuales fueron identificados en P. notatum y otras especies de gramíneas. Sin embargo, hasta el momento solo unos pocos de ellos han sido estudiados en detalle a nivel genético y funcional. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue profundizar los estudios tendientes a determinar las características citogenéticas y moleculares del locus responsable de la aposporía en P. notatum y caracterizar genes cuya expresión fue asociadas a la apomixis en gramíneas así como secuencias genómicas localizadas específicamente en el locus de la aposporía. En el Capítulo I se describen los estudios citogenéticos realizados en meiocitos de plantas apomícticas y sexuales de P. notatum. Como material vegetal fueron incluidas cinco accesiones apomícticas naturales, tres individuos sexuales obtenidos experimentalmente y 16 híbridos F1 clasificados por el modo de reproducción. Las observaciones citogenéticas revelaron que tanto las plantas apomícticas como las sexuales presentaron algunas anormalidades meióticas como, cromosomas rezagados, puentes de cromatina y micronúcleos. Sin embargo, un análisis cuantitativo de éstas reveló diferencias significativas entre las accesiones apomícticas y sexuales. Asimismo, el análisis de los híbridos confirmó las diferencias observadas en los progenitores con diferente modo de reproducción. Un estudio de FISH reveló que el ACL se encuentra en hemicigosis, muy próximo a regiones ricas en heterocromatina. Los resultados presentados en este Capítulo demostraron que las plantas apomícticas presentan un mayor número de anormalidades meióticas en la anafase I que las sexuales y que estas anormalidades se transmiten a la descendencia asociadas con el modo de reproducción. Asimismo fue posible determinar que el locus responsable de la aposporía se transmite solo a uno de los productos de la meiosis I. Esta estructura cromosómica podría explicar la distorsión de la segregación y la supresión de la recombinación asociada a la transmisión de la apomixis en la especie. En el Capítulo II se describe la caracterización molecular de los genes SERK y EXS en P. notatum. El gen SERK (somatic embryogenesis receptor like kinase) fue asociado a la apomixis en Poa pratensis. A partir del apilamiento de secuencias conocidas fue posible aislar dos secuencias genómicas de P. notatum con alta similitud a genes SERK: PnSERK1 (1750 pb) y PnSERK2 (2050pb). Al menos 3 copias de PnSERK están presentes en el genoma de P. notatum. Estudios de expresión por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en diferentes estadios del desarrollo reproductivo del genotipo Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) mostraron que PnSERK2 se expresa a niveles superiores de PnSERK1 y que muestra diferencias significativas en los estadios de premeiosis, postmeiosis y antesis entre ambos genotipos. Experimentos de hibridación in situ de tejidos, mostraron una expresión contrastante entre el genotipo sexual y el apomíctico. Los resultados obtenidos indican que PnSERK2 presenta una expresión diferencial entre plantas apomícticas y sexuales y podría formar parte de la cascada de genes asociados a la expresión de la apomixis en P. notatum. Se analizó también el gen EXS. Una secuencia codificante para el dominio EXS fue identificada en un clon de BAC conteniendo marcadores moleculares completamente ligados a la aposporía en P. simplex. Mediante experimentos similares a los descriptos anteriormente se aisló un fragmento de 2298 pb con alta similitud al gen EXS de arroz y maíz de los genotipos Q4188 y Q4117. El análisis del número de copias reveló que existen entre 2 y 4 secuencias homólogas en el genoma de P. notatum. Estudios de expresión por qRT-PCR no mostraron diferencias significativas entre los genotipos sexuales y apomícticos en distintos estadios del desarrollo reproductivo. Sin embargo, estudios de hibridación in situ de tejido mostraron expresión de EXS en tejido ovárico del genotipo sexual mientras que solo se observó expresión en células que rodean a los sacos embrionarios en el genotipo apomíctico. El análisis de mapeo in silico, indicó que PnEXS se localiza en regiones que ya han sido reportadas como asociadas a la aposporía. Estos resultados indican que PnEXS podría estar diferencialmente regulado en plantas apomícticas y sexuales. En el Capítulo III se presentan los estudios realizados en la caracterización de secuencias específicas del ACL en P. notatum y el mapeo de transcriptos de ARNm asociados con el modo de reproducción. Varias de las secuencias correspondientes al ACL mostraron similitud con elementos repetitivos, proteínas hipotéticas, proteínas ribosomales y dominios codificantes. El mapeo de seis transcriptos expresados diferencialmente entre plantas apomícticas y sexuales mostró que N54 resultó ligado en repulsión al ACL. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron detectar la presencia de un rearreglo cromosomal que se trasmite a la progenie asociado a la aposporía. Además, se logró localizar el ACL en un único cromosoma de P. notatum y determinar su condición hemicigota. Paralelamente, se pudo demostrar que PnSERK2 se encuentra funcionalmente asociado a la aposporía y que PnEXS estaría regulado diferencialmente en plantas apomícticas y sexuales. El análisis de marcadores 100% ligados al carácter puso en evidencia la presencia de secuencias codificantes que podrían estar asociadas a la aposporía.
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    Sequence characterization, in silico mapping and cytosine methylation analysis of markers linked to apospory in Paspalum notatum
    (Sociedade Brasileira de Genética, 2012-07-01) Podio, Maricel; Rodríguez, María Pía; Felitti, Silvina; Stein, Juliana; Martínez, Erci Javier; Siena, Lorena Adelina; Quarin, Camilo Luis; Pessino, Silvina Claudia; Ortiz, Juan Pablo Amelio