Análisis de Conservación y Microsintenía de la Región Genómica Responsable de la Apomixis (acr) en Paspalum notatum

La apomixis es una forma de reproducción clonal por semillas que origina progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Este carácter fija naturalmente cualquier combinanción genética y por lo tanto es de gran interés para el mejoramiento. La apomixis está ampliamente difundida en las angiospermas, pero no se encuentra en las especies de gran cultivo. Solamente algunos géneros de gramíneas forrajeras subtropicales, el mango y las fresas presentan naturalmente este tipo de reproducción. La manipulación del carácter y su transferencia a los cultivos mayores puede tener un gran impacto en la agriculura. En la apomixis de tipo gametofítica, los embriones maternos se desarrollan por partenogénesis (sin fecundación) a partir de sacos embrionarios no reducidos (sea) derivados de células somáticas del óvulo (aposporía), o de la propia célula madre de la megáspora (diplosporía) luego de una falla en la meiosis. Varios autores sugieren que la apomixis puede derivar de cambios genéticos o epigenéticos de vías claves de la sexualidad. Paspalum notatum es una gramínea rizomatosa perenne que forma complejos agámicos y multiploides en los cuales el citotipo diploide se reproduce sexualmente, mientras que el tetraploide se reproduce por apomixis de tipo apospórica. La apomixis está controlada por un locus complejo, localizado en una región genómica de aproximadamente 36 Mpb, denominado acr (por Apospory Controlling Region), que presenta una segregación distorsionada, ausencia de recombinación y una alta metilación de citosinas. Este segmento cromosómico, está asociado (presenta sintenía) a regiones de los cromosomas 2 y 12 de arroz (Os2 y Os12), pero su constitución génica y estructural es aún desconocida. El objetivo de este trabajo fue determinar la conservación de los segmentos cromosómicos de arroz asociados al acr en diferentes especies de gramíneas, determinar su contenido génico, analizar los posibles patrones de expresión de los genes presentes durante el desarrollo reproductivo e identificar regiones genómicas asociadas al acr utilizando un borrador del genoma de un citotipo diploide de P. notatum. XIII Resumen Como material vegetal se utilizaron los genotipos tetraploides Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico), una población F1 de 18 híbridos derivada del cruzamiento entre ellos y ocho genotipos apomícticos. La caracterización del modo reproductivo del material vegetal fue realizada mediante observaciones citoembriológicas de ovarios clarificados en estado de antesis y por análisis moleculares utilizando el marcador scar spna2, que se encuentra completamente ligado a la apomixis en la especie. Ambos estudios mostraron resultados concordantes en los individuos ensayados a excepción del genotipo Q3664 (un genotipo apomíctico facultativo), el cual presentó sea y ausencia del marcador. Este resultado indicaría que Q3664 sería un recombinante para el marcador utilizado y el acr, en esa región. El genotipo presenta un bajo porcentaje de expresión de la aposporía (11 %) con respecto a los genotipos apomícticos obligados (65 a 89 %) que sí contienen el marcador. A fin de validar la asociación del cromosoma Os2 con el acr, se identificaron transcriptos de P. notatum con homología al marcador de rflp C932 (que mapea en dicha región de arroz y que codifica para un gen ppi) expresados en los transcriptomas reproductivos sexual y apomíctico. Como resultado se obtuvieron cinco secuencias homólogas a partir del trascriptoma sexual y tres del apomíctico, respectivamente. Mientras los cinco transcriptos sexuales fueron semejantes al gen de arroz, los transcriptos apomícticos resultaron variables; una de las formas mostró semejanzas con el gen funcional, otra resultó un pseudogen sin aparente capacidad codificante, y el tercero resultó un transcripto quimérico, codificante para los dominios ppi y dnaj. El mapeo de las secuencias genómicas de cada transcripto en la población F1 segregante, demostró que la forma quimérica del gen segrega completamente ligada al carácter apomixis. Este resultado confirmó la asociación del segmento del cromosoma Os2 con el carácter y determinó que la forma quimérica es la que se encuentra en el acr. Los estudios de conservación de los segmentos de arroz demostraron que las regiones de los cromosomas Os2 y Os12 sinténicas al acr de P. notatum presentan una alta conservación en el contenido y orden génico respecto a seis de las siete especies del género Oryza estudiadas (O. sativa grupo Indica, O. barthii, O. brachyantha, O. glaberrima, O. glumipatula, O. punctata). Sin embargo, para el caso de Sorghum bicolor, se identificó una inversión de 6 Mpb y en Oryza nivara, se detectaron bloques de sintenía translocados entre los cromosomas homólogos al Os2 y Os12. A fin de analizar los posibles patrones de expresión de los genes presentes en los segmentos de arroz asociados al acr se estudió un transcriptoma floral por estadios del desarrollo reproductivo apomíctico y sexual de P. notatum. Este estudio reveló que la mayor parte de los transcriptos codificantes diferenciales están sobrexpresados en el XIV Resumen genotipo apomíctico. Además, se observó que en los cromosomas Os2 y Os12 se localiza una proporción mayor de transcriptos sobrexpresados del genotipo apomíctico que en el resto de los cromosomas. Un análisis similar mostró que el Os12 presenta la mayor proporción de transcriptos no codificantes sobrexpresados en el genotipo apomíctico. A partir de la disponibilidad de un borrador del genoma de un citotipo diploide de P. notatum, se detectaron scaffolds asociados al acr mediante el mapeo de 17 secuencias que cosegregan con la apomixis. Este análisis identificó 10 scaffolds que fueron caracterizados por su contenido génico. Las secuencias identificadas determinaron que presentan regiones sinténicas a las regiones cromosómicas de arroz asociadas al acr, presentando además una alta conservación en el contenido y orden génico. Estos resultados indican que el genoma diploide contiene, al menos parcialmente, el acr presente en los citotipos tetraploides. Uno de los scaffolds estudiados (utg001125l) contiene genes homólogos a genes de arroz localizados en las regiones sinténicas de los cromosomas Os2 y Os12, lo cual podría representar el sitio de yuxtaposición de la sintenía mixta del acr. El escrutinio detallado de las secuencias de arroz identificadas en cada uno de los análisis nos permitió identificar una lista de 100 candidatos para futuros estudios referidos a la apomixis entre los cuales los genes ppi, huellenlos, exs, ttg1 y mt-a70 aparecen como los más relevantes.