Examinando por Autor "Permingeat, Hugo R."
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Ítem Acceso Abierto Caracterización del mecanismo de resistencia a inhibidores ALS y glifosato en una subpoblación de Amaranthus palmeri identificada a campo(2019) Palmieri, Valeria E.; Perotti, Valeria E.; Permingeat, Hugo R.La aparición de poblaciones de malezas con resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) y glifosato trajo como consecuencia la reducción en la utilidad práctica y económica de estas herramientas químicas e importantes pérdidas en la producción. Amaranthus palmeri S. Watson es una especie muy competitiva que, en los últimos años, se ha convertido en un grave problema en los cultivos de soja de la zona núcleo de nuestro país. A. palmeri se caracteriza por tener alta tasa de crecimiento, elevada tolerancia a los ambientes adversos, gran variabilidad genética y facilidad para desarrollar resistencia a herbicidas. Esta maleza se detectó por primera vez en Argentina durante la campaña 2011-2012 en el sur-oeste de la provincia de Córdoba. En A. palmeri, la mayoría de los casos de resistencia a inhibidores de la ALS son debido a cambios en la secuencia de bases del gen de la ALS, mientras que la resistencia a glifosato se debe principalmente a la amplificación del gen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Fundamentalmente en el caso de los inhibidores de la ALS, una misma mutación en el gen blanco puede causar resistencia a más de un principio activo (resistencia cruzada). Si éste es el caso, el espectro de herramientas químicas factibles para el control de la población en cuestión se acota notablemente. Asimismo, si se identifica una mutación puntual que genera resistencia sólo a una determinada familia química, se puede plantear el uso de alguna de las otras familias de herbicidas, aumentando las posibilidades de éxito en el manejo de dicha maleza. Así, la dilucidación de las bases moleculares que explican el fenotipo de resistencia de diferentes subpoblaciones de malezas halladas a campo es de gran utilidad para el diseño racional de estrategias de control. Además, la obtención de información genética novedosa que pueda ser transferida a especies de interés agronómico constituye una potencial herramienta biotecnológica para abordar una de las principales problemáticas de la agricultura actual. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en identificar las bases moleculares responsables del fenotipo de resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS y glifosato observado en plantas de A. palmeri halladas a campo, con énfasis en el hallazgo y la caracterización de nuevas mutaciones en el sitio de acción de los herbicidas inhibidores de la ALS. Mediante estudios de dosis-respuesta, bioquímicos y moleculares, se confirmó que la subpoblación de A. palmeri hallada en lotes con cultivo de soja en la localidad de Totoras tiene resistencia cruzada a imazetapir, clorimurón-etil y diclosulam y que la resistencia a inhibidores de la ALS se debe a un mecanismo asociado al sitio de acción, de mutación de punto en la secuencia codificante del gen ALS. Se identificaron dos sustituciones de aminoácidos (W574L y S653N) en la enzima ALS previamente reportadas en la especie y cuatro sustituciones (A122S, A282D, D376E y A205V) detectadas por primera vez en A. palmeri en este trabajo de tesis. Las distintas versiones de la enzima ALS halladas fueron expresadas de forma heteróloga en sistemas procariotas y posteriormente purificadas a fin de evaluar su cinética y respuesta inhibitoria frente a los herbicidas, con énfasis en la sustitución A122S, que sólo se había observado en levaduras hasta el momento. Los resultados obtenidos demuestran que la sustitución A122S disminuye la susceptibilidad de la enzima frente a herbicidas de cuatro familias químicas diferentes y que la sustitución A282D no proporciona resistencia a los herbicidas del grupo B. También se detectó una disminución en la eficiencia catalítica en las enzimas con las sustituciones A122S, S653N, A205V, y W574L; al tiempo que las dos últimas fueron las únicas que produjeron una disminución de la afinidad de la enzima por el sustrato. Por otro lado, se obtuvieron individuos propagados asexualmente con las sustituciones en la enzima ALS: A122S, A205V o D376E reportadas por primera vez en esta especie en este trabajo de tesis y se evaluó el nivel de resistencia in vivo que proporciona cada una de ellas. Las tres sustituciones otorgan resistencia cruzada a los herbicidas del grupo B, siendo la primera vez que se informa que la sustitución A205V confiere resistencia a un herbicida de la familia de las triazolopirimidinas. Por último, mediante ensayos fenotípicos y moleculares se confirmó la resistencia a glifosato de la subpoblación A. palmeri de Totoras. La resistencia es causada principalmente por una mutación puntual en el gen EPSPS (P106S). Además, se detectó la contribución de un mecanismo ajeno al sitio blanco, en concordancia con lo reportado para una población cercana (geográficamente) a la estudiada. Futuros experimentos son necesarios para caracterizar este mecanismo. Dada la propensión de A. palmeri a desarrollar resistencia a múltiples modos de acción, es importante detectar rápidamente nuevos casos de poblaciones resistentes y determinar el mecanismo de resistencia involucrado, con el fin de diseñar estrategias de manejo sostenibles.Ítem Acceso Abierto Caracterización del mecanismo responsable de la resistencia a HALOXIFOP-P-METIL y Glifosato en Sorghum halepense(FCA-UNR, 2020) MARTINATTO, ANDREA K.; Permingeat, Hugo R.; Perotti, ValeriaLos herbicidas son una importante herramienta en la producción agrícola para controlar malezas, evitar la erosión del suelo y mantener altos rendimientos. En Argentina, el modelo agro-productivo consolidado en las últimas décadas se basa en el cultivo de soja transgénica tolerante a glifosato (ya sea en monocultivo, o bien, en una rotación con maíz transgénico tolerante al mismo herbicida). Sin embargo, la elevada eficacia combinada con la simplicidad de operación de estos sistemas resultó en el uso excesivo de un pequeño número de herbicidas. Esto trajo como consecuencia inmediata una disminución en la diversidad productiva, una reducción sustancial en la abundancia de numerosas especies de malezas y la evolución de biotipos resistentes. El primer caso de resistencia a herbicidas en Argentina fue detectado en 1996, y al día de la fecha existen 18 especies diferentes que han desarrollado resistencia al menos a un herbicida, ascendiendo este número a 262 especies a nivel mundial. Así, la resistencia a herbicidas en malezas representa hoy uno de los problemas más importantes que enfrentan los sistemas agropecuarios en todo el mundo. El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Persoon) ha sido introducido al país con propósitos forrajeros, pero actualmente es considerada una de las malezas más problemáticas del mundo, causando grandes pérdidas económicas. Es una gramínea C4, perenne y alotetraploide. Sus características la vuelven una especie sumamente competitiva, interfiriendo con los barbechos previos a cultivos primavero-estivales como soja, maíz o girasol. El principal inconveniente que presenta para su control químico eficaz y económico es su carácter de perennidad a través de la formación de rizomas de gran extensión y biomasa, especialmente en condiciones de ausencia de labranza. Este atributo es el que dificulta marcadamente el control mediante tratamientos con herbicidas sistémicos post-emergentes. En este trabajo de tesis se caracterizó la resistencia múltiple a herbicidas inhibidores de la ACCasa y a glifosato de una subpoblación de Sorghum halepense hallada en campos de Gobernador Crespo (GC-R). Los ensayos in vivo con haloxifop-p-metil mostraron que la subpoblación GC-R es altamente resistente con valores de LD50 y GR50 mayores a ocho veces la dosis recomendada a campo. Experimentos de dosis respuesta sobre ciertos individuos seleccionados de esta subpoblación (GC-C4, GC-C6 y GC-C7) permitieron explicar la resistencia observada y justificar los valores de GR50 y LD50 de la subpoblación original. A su vez, los estudios XI moleculares de secuencias nucleotídicas permitieron identificar dos mutaciones en el gen de la ACCasa. Las sustituciones provocadas por estos cambios (I2041N y A2096G) fueron reportadas previamente como responsables de conferir altos niveles de resistencia a varios principios activos de herbicidas del grupo A. Además, se encontró una sustitución no reportada (IXXXXT) sobre el dominio CT de la ACCasa, exclusiva de la subpoblación en estudio, que podría estar implicada en el fenotipo de resistencia. La identificación de nuevos alelos que confieren resistencia resulta de gran interés por su potencial aplicación en el desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas. Por otra parte, los estudios de qPCR realizados indicaron la ausencia de un mecanismo de amplificación génica. Además, no se encontraron evidencias para postular a un mecanismo de resistencia metabólica contribuyendo de manera significativa a la resistencia. Por consiguiente, los resultados obtenidos confirman que la resistencia a haloxifopp-metil de la subpoblación GC-R se debe principalmente a un mecanismo asociado al sitio de acción. Con respecto al glifosato, los estudios de dosis respuesta confirmaron la resistencia de la subpoblación GC-R con un valor de LD50 poco mayor a la dosis recomendada a campo. Sin embargo, la biomasa remanente se vio severamente afectada a dicha dosis. Los estudios moleculares permitieron descartar un mecanismo asociado al sitio de acción (mutaciones en la secuencia y amplificación del gen EPSPS), de acuerdo con lo reportado previamente para esta maleza. La profunda caracterización de los mecanismos de resistencia en la subpoblación GCR, derivó en el desarrollo y optimización de una PCR cuantitativa alelo específica (ASqPCR) que posibilita la identificación rápida y confiable de la relación de alelos mutados respecto a los alelos salvajes en individuos de una especie poliploide con múltiples copias del gen bajo estudio. Finalmente, se logró expresar de manera recombinante y obtener en fase soluble el dominio CT de la ACCasa de Sorghum halepense. La obtención de las distintas versiones alélicas del dominio CT recombinante abre las puertas para su caracterización funcional en presencia de inhibidores y para la exploración de nuevas sustituciones implicadas en la resistencia. Así, la optimización de esta herramienta de análisis representa una estrategia prometedora a fin de evaluar alelos novedosos que puedan encontrarse en poblaciones naturalmente resistentes.Ítem Acceso Abierto Manejo de la podredumbre morena (Monilinia fructicola) en durazno a través del uso de fosfitos como activadores de resistencia y su efecto sobre la calidad poscosecha(Facultad de Ciencias Agrarias. UNR, 2023) Leone, Andrea Inés; Mitidieri, Mariel S.; Permingeat, Hugo R.La podredumbre morena causada por Monilinia fructicola (G.Winter) honey es una enfermedad muy destructiva en cultivos comerciales de frutales de carozo en el mundo y en la Argentina. Genera pérdidas directas ante la infección de flores y podredumbre de frutos en pre y poscosecha, así como pérdidas indirectas debidas al alto costo de aplicación de fungicidas durante el período de floración y de desarrollo de frutos hasta la poscosecha. Tradicionalmente, el control de enfermedades en cultivos frutales a lo largo del mundo depende del uso de fungicidas, pero esta práctica es cada vez menos aceptable por parte de los consumidores, ya que ocasionan daños al medio ambiente y a la salud humana. Las nuevas estrategias de manejo incluyen el uso de inductores de resistencia como fosfatos de potasio, sodio o magnesio, fosetil aluminio, ácido salicílico, acibenzolar s-metílico, quitosano, silicato de potasio y fosfitos entre otros. En el cultivo de duraznero, los tratamientos preventivos con activadores de resistencia, como fosfitos de potasio y calcio, reducen el crecimiento del patógeno y reducen la susceptibilidad del hospedante a M. fructicola. Estos activadores, mejoran la calidad post cosecha del fruto. Por lo tanto, la presente investigación se llevó a cabo con los siguientes objetivos: 1) Evaluar el efecto de fosfitos de potasio y calcio sobre el crecimiento y reproducción de M. fructicola; 2) Determinar el efecto de los tratamientos con fosfitos de potasio y calcio sobre la expresión de síntomas frente a la infección por M. fructicola en distintas etapas del crecimiento del fruto 3) Determinar el efecto de los tratamientos con fosfitos sobre la expresión de compuestos asociados a mecanismos de resistencia inducida a M. fructicola, en distintas etapas del crecimiento del fruto y en distintos cultivares de duraznero; 4) Evaluar el efecto de tratamientos precosecha con fosfitos y fosfitos en mezcla con fungicidas, sobre el desarrollo poscosecha de podredumbre morena y caracterizar el efecto de los tratamientos mencionados, sobre parámetros de calidad poscosecha de frutos; 5) Evaluar el impacto ambiental de diferentes estrategias de control incluyendo la aplicación de fosfitos. Para evaluar el efecto de fosfitos sobre el crecimiento del patógeno se llevaron a cabo experimentos in vitro donde se probaron diferentes dosis de fosfito de potasio (FFK: 0,1%, 0,2% y 0,3%) y de calcio (FFCA: 0,1%, 0,2% y 0,3%). Previamente se aislaron diferentes cepas de M. frutícola a las que se les hizo estudio molecular mediante PCR. Los fosfitos se evaluaron mediante el porcentaje de inhibición del tratamiento respecto al testigo. Para evaluar la efectividad sobre la germinación de conidios se utilizó la técnica de microdilución en caldo, en la cual se probaron ocho diluciones de ambos fosfitos, un testigo químico y un testigo con agua. Se midió la efectividad de los tratamientos sobre la germinación mediante el porcentaje de inhibición de unidades formadoras de colonias. Para evaluar el efecto de los fosfitos sobre la expresión de síntomas, se cosechó fruta desde un mes de plena floración a cosecha en dos cultivares de duraznero, Flordaking y Elegant lady. Una vez cosechados se los pulverizó con diferentes dosis de fosfitos de potasio y calcio (0,1%, 0,2% y 0,3%) en laboratorio, y se incluyó un control negativo tratado con agua. A la mitad de los frutos se los inoculó con una suspensión de conidios (105 - 106 ) de M. fructicola con micropipeta en la zona de la sutura; mientras que a la otra mitad se le practicó una herida a una profundidad de 2 mm con un punzón estéril, previo a ser sumergido en la misma solución de conidios. Las variables analizadas fueron incidencia y severidad a los 3 y 7 días de inoculación, en cada muestreo o cosecha. Este experimento se repitió con aplicaciones de fosfitos en precosecha (pulverización en planta). Para evaluar el efecto de los fosfitos sobre la expresión de compuestos asociados a los mecanismos de resistencia se midió fenoles totales y ácido clorogénico (ACG) en pulpa y piel de ambos cultivares de duraznero en tres estados fenológicos: fruto verde (FV), endurecimiento de carozo (EC) y cosecha (Cs). En las experiencias en las que se extrajeron metabolitos de la piel, se inocularon los frutos con una suspensión de conidios de M. fructicola; y se determinó la concentración de los mencionados metabolitos a 6 h de la inoculación. Se midió también actividad enzimática polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) en piel de frutos de ambos cultivares en dos estados fenológicos (EC y Cs) a tiempo 0 (sin inóculo) y a 6, 24 y 48 h de inoculados con una suspensión de conidios de M. fructicola. El contenido de fenoles totales y de ACG se expresó en µg/gpf y las actividades enzimáticas en U/mg proteína. Se hicieron también experimentos donde se evaluó el efecto de los fosfitos solos y en combinación con fungicidas sobre el desarrollo poscosecha de podredumbre morena y sobre parámetros de calidad poscosecha. Las aplicaciones de los tratamientos se hicieron a 30, 15 y 7 días antes de cosecha. Para esto se midió la incidencia y severidad de la enfermedad a 3 y 7 días de cosechado. También se cosecharon 20 frutos/tratamiento/repetición y se les evaluó color con colorímetro midiendo los valores CIE L*a*b* y calculando también los parámetros ángulo de tono (H= tan-1(b*/a*)) y croma o saturación (C*= (a*2+b*2)1/2); peso, calibre, firmeza con penetrómetro y sólidos solubles totales (SST) con un refractómetro. Finalmente, para evaluar el impacto ambiental de los fosfitos se utilizó el Coeficiente de Impacto Ambiental (EIQ), bajo tres estrategias fitosanitarias para el control de M. fructicola. En los experimentos in vitro los fosfitos de potasio (FFK) en sus dosis más altas (0,2% y 0,3%) y fosfitos de calcio (FFCA) 0,3% resultaron ser más efectivos para inhibir el crecimiento del hongo. Los fosfitos de potasio fueron más efectivos que los fosfitos de calcio. Las diferentes cepas respondieron de manera diferente ante los fosfitos. Se encontró una concentración mínima inhibitoria (CMI) con fosfito de potasio al 0,5%, no así con el fosfito de calcio. Se requirieron dosis más altas de fosfitos para inhibir germinación de conidios respecto al crecimiento micelial del hongo. En la evaluación de expresión de síntomas, ambos experimentos (poscosecha y precosecha) arrojaron diferencias significativas entre los diferentes estados de desarrollo del fruto en ambos cultivares ante la infección con M. fructicola. También se manifestó diferencias entre frutos heridos y no heridos. ´Flordaking´ presentó mayor predisposición a enfermarse con podredumbre morena en estado de cosecha, mientras que esa predisposición disminuyó al final del periodo de endurecimiento de carozo. Por otro lado, ´Elegant lady´ manifestó un comportamiento más variable en la predisposición a la infección. Sin embargo, la susceptibilidad a podredumbre morena fue elevada en periodo de maduración del fruto. En la etapa de endurecimiento de carozo, fue variable su predisposición a contraer enfermedad con un pico entre los 73 y 75 días después de plena floración (DDPF), que se repitió en los diferentes años con condiciones climáticas diferentes. Los fosfitos arrojaron resultados variables en ambos cultivares; sin embargo, los FFK en sus tres dosis y FFCA 0,3% manifestaron mayor efectividad en ´Flordaking´ a finales del periodo de endurecimiento del carozo y durante la etapa de maduración con valores de incidencia y severidad entre un 20 y un 15% menos respecto al testigo a 90 y 95 DDPF. ´Elegant lady´ manifestó mayor efectividad de los FFK 0,2%, FFK 0,3% y FFCA 0,3% en periodo de endurecimiento de carozo, para la variable incidencia. Ante la aplicación de fosfitos ´Flordaking´ respondió con aumento de fenoles totales, e inducción de actividad enzimática PPO en ausencia del patógeno y a 6 h de inoculado, en estado de cosecha con aplicaciones de FFCa 0,3%. Por otro lado, en presencia de inóculo el ACG cayó en todos los tratamientos y estados de desarrollo, salvo FFCA 0,3% en EC. Además, indujo actividad POD a 6h de inoculación ante tratamientos de FFK 0,3%. ´Elegant lady´ mostró una disminución de fenoles totales y un aumento de ACG en los estados de EC y Cs en respuesta a M. fruticola. La PPO y la POD no indujeron actividad ante aplicaciones de fosfitos. Los tratamientos con fosfitos solos y en combinación con fungicida no arrojaron diferencias ante el desarrollo de la enfermedad en ninguno de los dos cultivares, sin embargo, se evidenció una clara tendencia de mayor efectividad de los FFK 0,3% en combinación con fungicidas. Estos resultados quizás podrían mejorarse con el agregado de un coadyuvante. Los fosfitos no tuvieron efecto sobre el color de piel para ninguno de los dos cultivares. Los tratamientos con fungicidas solos o en combinación con FFCa aumentaron los SST en frutos de ambos cultivares. Además, la combinación de FFCa + fungicidas mejoraron el peso de frutos ´Florfaking´. La combinación FFCa + fungicida tuvo mejores resultados como bioestimulantes que el FFK y manifestó mayor respuesta en el cultivar Flordaking, respecto a ´Elegant lady´. A partir de esta investigación se puede confirmar el efecto directo de los fosfitos sobre el crecimiento de M. fructicola in vitro. Es escasa la información existente sobre el efecto de los fosfitos en el patosistema M. fructicola – Prunus persica (duraznero). Aplicaciones preventivas de fosfitos en poscosecha no afectan la curva de susceptibilidad del hospedante ante M. fruticola, pero podrían disminuir la expresión de síntomas en frutos en estado de cosecha y podrían tenerse en cuenta en planta de empaque dando protección al fruto frente a la enfermedad durante el almacenamiento. Por otro lado, el FFCA 0,3% podría presentar efecto indirecto sobre el hospedante al expresar compuestos asociados a los mecanismos de resistencia inducida, aunque no alcanza para contrarrestar la enfermedad. El valor de impacto ambiental de las diferentes estrategias evaluadas fue muy bajo. El EIQ inicial de los FFK es menor al del Tebuconazole, debido al bajo riesgo al aplicador, consumidor y ecológico. Dentro de un sistema productivo sustentable, los fosfitos podrían ser una alternativa de bajo impacto ambiental y a la salud humana, a tener en cuenta dentro del calendario de control bajo una estrategia de manejo integrado.Ítem Acceso Abierto OsttaSBEIII expression alters granule size and increases starch levels and its degradability in Arabidopsis(Elsevier B.V., 2023-05-15) Hedin, Nicolas; Barchiesi, Julieta; Zanor, María Inés; Permingeat, Hugo R.; Gomez Casati, Diego Fabián; Busi, María Victoria