Caracterización del mecanismo de resistencia a inhibidores ALS y glifosato en una subpoblación de Amaranthus palmeri identificada a campo

La aparición de poblaciones de malezas con resistencia a herbicidas inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) y glifosato trajo como consecuencia la reducción en la utilidad práctica y económica de estas herramientas químicas e importantes pérdidas en la producción. Amaranthus palmeri S. Watson es una especie muy competitiva que, en los últimos años, se ha convertido en un grave problema en los cultivos de soja de la zona núcleo de nuestro país. A. palmeri se caracteriza por tener alta tasa de crecimiento, elevada tolerancia a los ambientes adversos, gran variabilidad genética y facilidad para desarrollar resistencia a herbicidas. Esta maleza se detectó por primera vez en Argentina durante la campaña 2011-2012 en el sur-oeste de la provincia de Córdoba. En A. palmeri, la mayoría de los casos de resistencia a inhibidores de la ALS son debido a cambios en la secuencia de bases del gen de la ALS, mientras que la resistencia a glifosato se debe principalmente a la amplificación del gen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Fundamentalmente en el caso de los inhibidores de la ALS, una misma mutación en el gen blanco puede causar resistencia a más de un principio activo (resistencia cruzada). Si éste es el caso, el espectro de herramientas químicas factibles para el control de la población en cuestión se acota notablemente. Asimismo, si se identifica una mutación puntual que genera resistencia sólo a una determinada familia química, se puede plantear el uso de alguna de las otras familias de herbicidas, aumentando las posibilidades de éxito en el manejo de dicha maleza. Así, la dilucidación de las bases moleculares que explican el fenotipo de resistencia de diferentes subpoblaciones de malezas halladas a campo es de gran utilidad para el diseño racional de estrategias de control. Además, la obtención de información genética novedosa que pueda ser transferida a especies de interés agronómico constituye una potencial herramienta biotecnológica para abordar una de las principales problemáticas de la agricultura actual. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en identificar las bases moleculares responsables del fenotipo de resistencia a herbicidas inhibidores de la ALS y glifosato observado en plantas de A. palmeri halladas a campo, con énfasis en el hallazgo y la caracterización de nuevas mutaciones en el sitio de acción de los herbicidas inhibidores de la ALS. Mediante estudios de dosis-respuesta, bioquímicos y moleculares, se confirmó que la subpoblación de A. palmeri hallada en lotes con cultivo de soja en la localidad de Totoras tiene resistencia cruzada a imazetapir, clorimurón-etil y diclosulam y que la resistencia a inhibidores de la ALS se debe a un mecanismo asociado al sitio de acción, de mutación de punto en la secuencia codificante del gen ALS. Se identificaron dos sustituciones de aminoácidos (W574L y S653N) en la enzima ALS previamente reportadas en la especie y cuatro sustituciones (A122S, A282D, D376E y A205V) detectadas por primera vez en A. palmeri en este trabajo de tesis. Las distintas versiones de la enzima ALS halladas fueron expresadas de forma heteróloga en sistemas procariotas y posteriormente purificadas a fin de evaluar su cinética y respuesta inhibitoria frente a los herbicidas, con énfasis en la sustitución A122S, que sólo se había observado en levaduras hasta el momento. Los resultados obtenidos demuestran que la sustitución A122S disminuye la susceptibilidad de la enzima frente a herbicidas de cuatro familias químicas diferentes y que la sustitución A282D no proporciona resistencia a los herbicidas del grupo B. También se detectó una disminución en la eficiencia catalítica en las enzimas con las sustituciones A122S, S653N, A205V, y W574L; al tiempo que las dos últimas fueron las únicas que produjeron una disminución de la afinidad de la enzima por el sustrato. Por otro lado, se obtuvieron individuos propagados asexualmente con las sustituciones en la enzima ALS: A122S, A205V o D376E reportadas por primera vez en esta especie en este trabajo de tesis y se evaluó el nivel de resistencia in vivo que proporciona cada una de ellas. Las tres sustituciones otorgan resistencia cruzada a los herbicidas del grupo B, siendo la primera vez que se informa que la sustitución A205V confiere resistencia a un herbicida de la familia de las triazolopirimidinas. Por último, mediante ensayos fenotípicos y moleculares se confirmó la resistencia a glifosato de la subpoblación A. palmeri de Totoras. La resistencia es causada principalmente por una mutación puntual en el gen EPSPS (P106S). Además, se detectó la contribución de un mecanismo ajeno al sitio blanco, en concordancia con lo reportado para una población cercana (geográficamente) a la estudiada. Futuros experimentos son necesarios para caracterizar este mecanismo. Dada la propensión de A. palmeri a desarrollar resistencia a múltiples modos de acción, es importante detectar rápidamente nuevos casos de poblaciones resistentes y determinar el mecanismo de resistencia involucrado, con el fin de diseñar estrategias de manejo sostenibles.