Examinando por Autor "Ottado, Jorgelina"
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Ítem Acceso Abierto 3-methylcrotonyl Coenzyme A (CoA) carboxylase complex is involved in the Xanthomonas citri subsp. citri lifestyle during citrus infection(Public Library of Science (PLOS), 2018-06-07) Tomassetti, Mauro; Garavaglia, Betiana Soledad; Vranych, Cecilia Verónica; Gottig, Natalia; Ottado, Jorgelina; Gramajo, Hugo Cesar; Diacovich, LautaroÍtem Acceso Abierto Biotecnología aplicada a procesos de biorremediación de Mn(II)(2020) Ciancio Casalini, Lucila; Gottig, Natalia; Ottado, JorgelinaLa presencia de altas concentraciones de Mn(II) en aguas subterráneas utilizadas para el consumo humano es un problema ampliamente distribuido en Argentina, ya que afecta su calidad desde el punto de vista de aceptabilidad, operativo y sanitario. Desde hace algunos años, los métodos fisicoquímicos usualmente empleados para el tratamiento de aguas contaminadas con Mn comenzaron a ser sustituidos por procesos de remoción biológica debido a que éstos son eficientes, económicos y no presentan impacto ambiental negativo. Dichos procesos se basan principalmente en el uso de filtros de grava y arena sobre los cuales las bacterias indígenas del agua desarrollan biofilms y llevan a cabo la oxidación del metal con gran eficiencia. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los tiempos requeridos para que estos biofilms maduren son demasiados extensos, haciendo que se retrase el inicio de la remoción del metal. Para mejorar dicha situación, a menudo, se recurre a técnicas de bioaumentación. En este trabajo, se estudió el efecto de la bioaumentación de filtros de arena con dos cepas ambientales oxidantes de Mn(II), Pseudomonas sagittaria MOB-181 y Pseudomonas resinovorans MOB-449, a través de distintas metodologías de inoculación. Los ensayos se realizaron en distintas épocas del año para evaluar, además, cómo impacta la temperatura del ambiente sobre la eficiencia de remoción de Mn de los filtros y sobre la comunidad bacteriana establecida en el interior de los mismos. Los resultados obtenidos demostraron que tanto a escala banco como a escala piloto, la presencia de la bacteria Pseudomonas sagittaria MOB- 181 permitió acelerar los tiempos requeridos para la remoción del Mn presente en aguas naturales, independientemente de la metodología de inoculación empleada. Por otro lado, se pudo determinar que la inoculación de los filtros con las bacterias Pseudomonas sagitaria MOB-181 y Pseudomonas resinovorans MOB-449 en simultáneo, no conduce a mejorías en las eficiencias de remoción del metal respecto a la inoculación de los filtros únicamente con la bacteria Pseudomonas sagittaria MOB-181, indicando que la presencia de la bacteria Pseudomonas resinovorans MOB-449 no confiere ventajas significativas al proceso. Con respecto al efecto de la temperatura, se comprobó que la misma interfiere directamente en el establecimiento de los consorcios bacterianos en el interior de los filtros y en el rendimiento de los mismos. Las bacterias que oxidan Mn(II) son muy diversas, y se cree que la mayoría de ellas oxidan el metal por medio de dos enzimas: las Multicobre Oxidasas (MCO) y las Hemoperoxidasas (HP). Sin embargo, no se conoce con certeza cómo es el mecanismo utilizado. La bacteria Pseudomonas resinovorans MOB-449 posee la capacidad de oxidar Mn(II) con mayor eficiencia a temperaturas más bajas (18 °C) de lo que lo hacen las demás bacterias oxidantes de Mn(II) (28 °C). Por este motivo, se consideró enriquecedor utilizar a la misma como un modelo de estudio para poder ampliar los conocimientos acerca de la oxidación biológica del metal. Se analizaron distintas condiciones de crecimiento de la bacteria y su capacidad de oxidar Mn(II) en cada una de ellas, pudiéndose determinar que la misma es capaz de oxidar el metal únicamente en condiciones de crecimiento estático. En esta misma condición, se observó que el crecimiento de la bacteria a 18 °C es estimulado por la presencia de Mn(II), lo cual pudo ser comprobado también mediante técnicas de microscopía confocal. Además, a dicha temperatura la bacteria no sólo presenta una mayor capacidad de oxidar el metal, sino que también el proceso comienza antes que a 28 °C. Estos resultados sugirieron una estrecha conexión entre el proceso de oxidación de Mn(II) con la movilidad celular y con la temperatura de crecimiento de la bacteria. Por otro lado, se realizó un análisis de proteómica a través del cual se pudo demostrar que el crecimiento a 18 °C tiene, en general, un efecto negativo sobre el proteoma de la cepa MOB-449, afectando diversos procesos celulares tales como, el metabolismo de la energía y la movilidad celular. Además, se determinó que la presencia de Mn(II) conduce a un incremento en los niveles de abundancia de diversas proteínas a 18 °C, entre las cuales se destacan los citocromos y citocromos c oxidasas. Estas observaciones sugirieron que, a 18 °C, la bacteria Pseudomonas resinovorans MOB-449 podría recurrir a la oxidación de Mn(II) como fuente de energía para su crecimiento, mediante un mecanismo en el que podrían intervenir citocromos o citocromos c oxidasas. Por último, mediante técnicas de qPCR se determinó que la expresión de genes que codifican para enzimas MCO, se encuentra inducida cuando la bacteria se crece en presencia de Mn(II), indicando que la misma también podría llevar a cabo la oxidación del metal por medio de dichas enzimas.Ítem Acceso Abierto Caracterización de bacterias utilizables en procesos de biorremediación de aguas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2019-03-22) Piazza, Ainelén; Gottig, Natalia; Ottado, JorgelinaLa presencia de Mn en aguas subterráneas para consumo humano causa problemas de orden estético y de aceptabilidad, organolépticos, operativos y sanitarios. Los métodos empleados para la remoción de Mn en el agua subterránea se pueden clasificar en: fisico-químicos y biológicos. En estos últimos, el Mn contenido en el agua es oxidado y precipitado con la ayuda de bacterias ambientales que suelen aparecer en forma natural en las aguas subterráneas que contienen Mn. Sin embargo, en estos procesos se alcanza una óptima remoción de Mn únicamente cuando los sistemas contienen comunidades bacteriana apropiadas, es decir, bacterias oxidantes de Mn y formadoras de biofilm. En este trabajo, se evaluaron los microbiomas de dos plantas de tratamiento biológico de aguas subterráneas que actualmente eliminan Mn(II) con alta eficiencia. Por otro lado, se cultivó un gran número de MOB conocidos y varios aislamientos que nunca antes se habían informado como MOB. La cepa MOB-181 del género Pseudomonas, se destacó de las demás por mostrar características de interés. La misma estuvo presente en el sistema de filtración de LT representando alrededor del 4 % del total de las Pseudomonas y pudo cultivarse con facilidad en el laboratorio. Asimismo, demostró buena capacidad de oxidación de Mn(II) en diferentes medios de crecimiento analizados; a diferentes temperaturas; y en presencia de metales inhibidores como el Fe y el propio Mn en altas concentraciones. Resultó ser una excelente formadora de biofilms y pudo oxidar Mn(II) presente en agua cruda mientras estuvo inmovilizada sobre arena. El estudio del rendimiento de la oxidación de Mn(II) de diferentes MOB aisladas en este trabajo permitió postular a MOB-181 como el mejor candidato con potencial para el desarrollo de un inóculo bacteriano aplicable para mejorar el proceso de eliminación de Mn(II) de aguas subterráneas. La oxidación de Mn y la formación de biofilms son dos características deseables para la elección de cepas con potencial uso en los procesos de remoción de Mn de aguas. A fin de determinar si estos dos procesos están relacionados en las MOB, se aplicaron ensayos de morfología de macrocolonia en agar y crioseccionamiento/microscopía para tratar de comprender la oxidación de Mn y la producción de EPS in situ en el modelo de biofilm de macrocolonia. Mediante el simple modelo de biofilm de macrocolonia, se pudo visualizar a los biofilms como sistemas biológicos complejos, donde los distintos grupos celulares están influenciados por un montón de factores, resultando en grupos de células diferentes dependiendo del entorno en el cual se encuentran. Finalmente, se construyó un sistema de filtros a escala laboratorio donde se evaluó la funcionalidad de la inoculación de filtros con MOB-181 en la remoción de Mn del agua. Se demostró que un ensayo de bioaumentación con esta bacteria fue capaz de acelerar el inicio de la remoción de Mn en aguas naturales. Asimismo, se observó que los tiempos requeridos para alcanzar la fase estacionaria de la remocion estaban fuertemente influenciados por las temperaturas, alcanzando más rapido la mayor eficiencia a temperaturas más altas. Estos resultados se utilizarán para optimizar los procesos de remoción de Mn de aguas y para el diseño de mejores tecnologías.Ítem Acceso Abierto Caracterización molecular del patógeno vegetal Xanthomonas citri subsp. citri(2020) Barcarolo, María Victoria; Ottado, Jorgelina; Garavaglia, Betiana SoledadXanthomonas citri subsp. citri (Xcc) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos. Durante el inicio del ciclo de vida de Xcc como epífita, ésta se enfrenta a diferentes situaciones de estrés, particularmente a condiciones con baja disponibilidad de agua y estrés osmótico, los cuales afectan su sobrevida epifítica sobre la superficie de la planta. Mediante análisis proteómicos y fisiológicos de Xcc cultivadas bajo estrés salino, simulando así las condiciones dadas durante la sobrevida bacteriana epifítica, se realizó un análisis exhaustivo de los mecanismos de adaptación de los fitopatógenos frente al estrés durante la colonización del tejido vegetal. El estudio de proteómica mostró que el estrés salino indujo cambios en la abundancia principalmente de proteínas involucradas en la quimiotaxis bacteriana, detoxificación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y en el metabolismo del exopolisacárido y de trehalosa. Además, se observaron alteraciones en la fisiología de Xcc bajo estrés salino, presentando una disminución de las motilidades tipo swimming, swarming y twitching, mayor formación de biofilm, aumento de la señal de quorum sensing DSF, mayor resistencia al estrés oxidativo, como así también, un aumento en los niveles de expresión de genes del sistema de secreción tipo III (SSTIII). En el estudio de proteómica, la proteína NAD(P)H deshidrogenasa codificada por el gen XAC2229, presentó la mayor abundancia. Se observó que Xac2229 juega un rol importante en la resistencia bacteriana de Xcc y de E. coli, frente al estrés oxidativo. Xac2229 favorece la sobrevida bacteriana en condiciones oxidativas, y a su vez, sería necesaria para disminuir la acumulación intracelular de ROS y la peroxidación lipídica, limitando el estrés oxidativo. Asimismo, Xac2229 sería necesaria durante la sobrevida epifítica de Xcc sobre el tejido vegetal de la planta de naranjo. Además, se identificó que Xac2229 presenta un comportamiento similar a las flavoproteínas, conteniendo FAD como cofactor. Conjuntamente, Xac2229 se caracterizó enzimáticamente, demostrando que posee actividad NADPH quinona reductasa. Por último, se identificaron y estudiaron dos proteínas de Xcc, Xac0100 y Xac4007, que participarían en la respuesta general a estrés, clasificadas como hidrofilinas. Se observó inducción de la expresión de XAC0100 y XAC4007 frente a diversas situaciones de estrés abiótico, como también durante la interacción planta-patógeno. Por otra parte, se concluyó que Xac0100 y Xac4007 juegan un rol importante en los primeros estadios del ciclo de vida epifítica de Xcc y, a su vez, participarían en la tolerancia frente a diversas situaciones de estrés abiótico. Por otro lado, la adición externa de Xac0100 y Xac4007 logró preservar la sobrevida celular bacteriana, y disminuir la inactivación enzimática de la proteína LDH, protegiendo las estructuras biológicas de los efectos del déficit hídrico. En síntesis, los resultados de este trabajo de tesis contribuyen al conocimiento sobre los mecanismos moleculares que ocurren durante la adaptación de Xcc frente a ambientes adversos, que afectan la progresión de la sobrevida epifítica bacteriana y determinan el desarrollo de la enfermedad.Ítem Acceso Abierto Estudio de genes involucrados en la interacción de Xanthomonas citri subsp. citri con plantas de naranja(2015) Ficarra, Florencia Andrea; Ottado, Jorgelina; Gottig, NataliaLas plantas se encuentran en continuo contacto con otros organismos, entre ellos un gran número de microorganismos son potencialmente patogénicos. En el presente trabajo de tesis se analizaron distintos aspectos de la interacción planta-patógeno, dentro de los cuales se encuentran el desarrollo de estructuras multicelulares como los biofilms, la regulación de la expresión de genes que codifican para componentes de estructuras esenciales para la virulencia y la participación de moléculas involucradas en la homeostasis de las plantas. A través de la construcción de una mutante en el gen oprB de Xcc, homólogo a porinas de carbohidratos en otras bacterias, se determinó que el mismo posee un rol en la formación del biofilm. Además, cepas deficientes en OprB muestran un desbalance en la producción del exopolisacárido xantano, siendo mayor la cantidad y más viscoso en ausencia de OprB. Por otro lado, vimos que la expresión de oprB depende de la presencia de azúcares en el medio, donde el gen se induce mayormente en presencia de monosacáridos. En relación a ello, la ausencia de OprB en Xcc da lugar a una reducción en el crecimiento en medio mínimo cuando estos azúcares están presentes como única fuente de carbono, y esto puede explicarse debido a una disminución en la incorporación del azúcar. El análisis de la producción de señales extracelulares que median el quorum-sensing muestra que las cepas deficientes en OprB secretan menores niveles de DSF, en concordancia con la incapacidad de formar biofilms. En estas cepas mutantes la virulencia también se ve comprometida, evidenciado por una menor formación de cancros y una menor supervivencia epifítica, sugiriendo un rol para OprB en los primeros estadíos de infección. El SSTT codificado por el cluster hrp es esencial para la virulencia y su regulación está a cargo del regulador HrpG. Una sustitución del residuo Arg210 por un residuo de Cys en la secuencia de HrpG implica una pérdida de la función en HrpG. La pérdida de función s evidencia debido a la incapacidad de éste de inducir la expresión de los genes blanco, tanto in vivo como in vitro, aún cuando la unión al ADN no se encuentra afectada. Experimentos de interacción proteína-proteína y proteólisis limitada sugieren que HrpG podría formar dímeros consigo misma o bien con la variante mutante del regulador y que en este último caso adoptaría un estructura diferente, que impediría que ejerza su función como factor transcripcional, donde el residuo de Arg210 es clave para la misma. Se estudió la participación de los PNPs en la homeostasis de la planta frente a la interacción planta-patógeno. Se vio que los PNPs se inducen en respuesta a la infección con patógenos. El tratamiento de plantas con XacPNP, un homólogo a PNPs en Xcc, resulta en una inducción de genes de defensa, y una menor tasa de crecimiento de Pst. Se construyeron plantas transgénicas con distintos niveles de PNPs para estudiar su función in vivo. Si bien las respuestas fueron sutiles, a grandes rasgos se observó que las plantas con mayores niveles de PNPs toleran mejor el estrés biótico y abiótico, por el contrario, plantas deficientes en PNPs se encuentran más afectadas frente al estrés, sugiriendo que los PNPs participarían en la homeostasis celular, tanto en respuesta a estrés biótico como abiótico. Los resultados obtenidos acerca del estudio de distintos aspectos de la interacción planta- patógeno, involucrados en la formación del biofilm y la regulación de la expresión de genes esenciales para la patogenicidad, y de la regulación de la homeostasis en la célula vegetal mediada por péptidos natriuréticos, contribuyen al avance en la investigación básica con respecto a la interacción planta-patógeno. El conocimiento de estos aspectos proporcionará nuevas estrategias para controlar, a largo plazo, las enfermedades de las plantas.Ítem Acceso Abierto Estudio de proteínas efectoras y proteínas regulatorias del sistema de secreción tipo tres del fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-03-13) Garofalo, Cecilia Graciela; Ottado, JorgelinaXanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) es el agente causal de la cancrosis de los cítricos, que afecta al género Citrus en todo el mundo. Debido a la ausencia de patovares resistentes a la enfermedad y la falta de mecanismo efectivos de control y erradicación, resulta interesante estudiar los mecanismos moleculares responsables de esta interacción planta-patógeno compatible. Entre los mecanismos de patogenicidad de Xac, el estudio de las proteínas efectoras y el rol que cumplen en la célula hospedadora, así como el estudio del regulador HrpG del SSTT son objeto de estudio en el presente trabajo de tesis. Estudios previos realizados en el laboratorio iniciaron la caracterización de las proteínas efectoras AvrXacE1, AvrXacE2, y Xac3090 de Xac, mediante ensayos de interacción con proteínas de Citrus sinensis en un sistema de doble híbrido en levaduras; y la construcción de cepas mutantes en dichas proteínas. En este trabajo de tesis se profundizó la caracterización de estos efectores de Xac construyendo una cepa doble mutante en los genes avrXacE1 y avrXacE2 y complementando las cepas mutantes construidas anteriormente.Ítem Acceso Abierto HrpE, the major component of the Xanthomonas type three protein secretion pilus, elicits plant immunity responses(Springer Nature, 2018-06-29) Gottig, Natalia; Vranych, Cecilia Verónica; Sgro, Germán Gustavo; Piazza, Ainelén; Ottado, JorgelinaLike several pathogenic bacteria, Xanthomonas infect host plants through the secretion of effector proteins by the Hrp pilus of the Type Three Protein Secretion System (T3SS). HrpE protein was identified as the major structural component of this pilus. Here, using the Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) HrpE as a model, a novel role for this protein as an elicitor of plant defense responses was found. HrpE triggers defense responses in host and non-host plants revealed by the development of plant lesions, callose deposition, hydrogen peroxide production and increase in the expression levels of genes related to plant defense responses. Moreover, pre-infiltration of citrus or tomato leaves with HrpE impairs later Xanthomonas infections. Particularly, HrpE C-terminal region, conserved among Xanthomonas species, was sufficient to elicit these responses. HrpE was able to interact with plant Glycine-Rich Proteins from citrus (CsGRP) and Arabidopsis (AtGRP-3). Moreover, an Arabidopsis atgrp-3 knockout mutant lost the capacity to respond to HrpE. This work demonstrate that plants can recognize the conserved C-terminal region of the T3SS pilus HrpE protein as a danger signal to defend themselves against Xanthomonas, triggering defense responses that may be mediated by GRPs.Ítem Embargo Identificación y caracterización de bacterias utilizables en procesos de biorremediación de ambientes contaminados con compuestos utilizados en la agricultura(2023) Masotti, Fiorella; Ottado, Jorgelina; Gottig, NataliaLos herbicidas de amplio espectro basados en glifosato (GP) (del inglés “Glyphosate Based Herbicides”, GBH) se han convertido en los más utilizados a nivel mundial. El GP (C3H8NO5P) es un miembro del grupo de compuestos químicos denominados fosfonatos, caracterizados por poseer el enlace carbono-fósforo (C-P). El uso extensivo de GBH, ha provocado que residuos de GP y de su principal metabolito de degradación, el ácido amino metilfosfónico (AMPA); se encuentren ampliamente distribuidos en el ambiente. Con la necesidad de prevenir la contaminación de los ambientes naturales y de buscar alternativas para su control y tratamiento, la biorremediación se ha considerado como una de las tecnologías más eficientes. En este contexto, en este trabajo de Tesis, se han aislado bacterias capaces de degradar el GP a partir de suelos de la provincia de Santa Fe con historia de repetidas aplicaciones con este herbicida. De un total de 62 aislamientos bacterianos con capacidad de crecer en presencia GBH como única fuente de fósforo, encontramos 13 especies diferentes pertenecientes a los géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Ochrobactrum, Pseudomonas y Pantoea. Se han caracterizado los perfiles de degradación del GP, GBH y AMPA de estos aislamientos bacterianos y la mayor eficiencia de degradación, se observó para las bacterias de los géneros Achromobacter, Agrobacterium y Ochrobactrum. El genoma de Agrobacterium tumefaciens CHLDO, seleccionada por ser una de las cepas que más eficientemente degrada el GBH, se secuenció y reveló la presencia de un grupo de genes phn (phnFGHJIKLOCDE2E1-duf1045phnNM), responsable de la metabolización de fosfonatos a través de la vía C-P liasa. El análisis de la expresión de los genes phn de A. tumefaciens CHLDO al crecer en presencia de GBH, o fosfato inorgánico como únicas fuentes de fósforo, mostró una inducción del cluster phn en presencia del herbicida, lo que sugiere una fuerte participación de esta vía en la degradación del GP. Además, la introducción de este cluster phn de A. tumefaciens CHLDO en el chassis heterólogo derivado de Pseudomonas putida KT2440, modificado para ser un auxótrofo de glicina (GLY), denominada SLTB7, permitió estudiar la degradación del GP a través de la vía C-P liasa. Dado que la GLY es un subproducto de la degradación de GP por esta vía, se ha desafiado a la degradación del GP acoplada al crecimiento bacteriano. La sobreexpresión del cluster phn demostró que la cepa SLTB7 es capaz de tolerar más el efecto de inhibición del crecimiento dado por el GP que la cepa control, aunque no es suficiente para revertir el fenotipo de auxotrofía. También se estudió la enzima blanco para el GP, conocida como EPSPS, de A. tumefaciens CHLDO (EPSPS_CHLDO). Esta enzima es esencial en plantas y microorganismos, por lo que su estudio es fundamental para determinar los efectos producidos por el GP en el ambiente. Se realizó un análisis in silico de las secuencias aminoacídicas de estas enzimas y se demostró que pertenecen a la clase III, tipo resistentes al GP. Además, la sobreexpresión de EPSPS_CHLDO en un plásmido o su inserción en el genoma de P. putida SLTB, generó una cepa más resistente al GP que la cepa parental. Por último, del análisis de los seis posibles promotores asociados al cluster phn de A. tumefaciens CHLDO, se pudo obtener dos biosensores para detectar la presencia de fosfonatos en el medio, basados en la región promotora del gen phnG. Asimismo, se realizó un biosensor que permite la detección de concentraciones de fosfato inorgánico (Pi) en el medio. Este último fue diseñado en base a la región promotora del gen phnC y respondió de manera inversamente proporcional a la concentración de Pi. En resumen, en esta Tesis se han aislado bacterias nativas con alta eficiencia de degradación de GP a partir de muestras ambientales; y los mecanismos moleculares involucrados en este proceso fueron transferidos a cepas bacterianas heterólogas. Los resultados obtenidos sientan las bases para la obtención de herramientas biotecnológicas que permitirán detectar y eliminar este herbicida del medio ambiente.Ítem Acceso Abierto Participación de las proteínas del sistema de secreción tipo III de Xanthomonas axonopodis pv. citri, Hpa1 y HrpE, en la interacción planta patógeno(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2014-07-02) Sgro, Germán Gustavo; Gottig, Natalia; Ottado, JorgelinaLa Cancrosis de los Cítricos es considerada en la actualidad una de las enfermedades más peligrosas y perjudiciales para la citricultura en Argentina y en el mundo, debido a los daños causados en la producción y calidad de los frutos, siendo Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) la bacteria fitopatógena responsable de esta enfermedad. Las bacterias fitopatógenas colonizan a sus hospedadores a través de la secreción de proteínas mediante el Sistema de Secreción de Tipo III (SST3). Este sistema está codificado por el cluster hrp, el cual es esencial para la patogenicidad en plantas hospedadoras y la inducción de HR en plantas no hospedadoras. El cluster hrp de Xac contiene un gen que codifica para una proteína harpin llamada Hpa1. Las harpin son proteínas estables al calor, ricas en glicina, que pueden formar poros en membranas, inducir HR en algunas plantas y formar estructuras fibrilares. Con el objetivo de estudiar la función de la proteína Hpa1 de Xac en la patogenicidad, se expresó y se purificó esta proteína en forma recombinante, y se generó la cepa mutante de Xac en el gen hpa1. A través de diversos estudios analizando los fenotipos generados tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, la expresión de sus genes en respuesta a la Hpa1, y los efectos que produce esta proteína sobre las células bacterianas, se logró determinar que la misma posee un rol dual en la patogenicidad de Xac, por un lado promoviendo la inducción de la respuesta de defensa basal de las plantas, y por otro aumentando la virulencia del patógeno, probablemente causando cambios en la estructura del mesófilo de las hojas de cítricos y promoviendo la agregación de las células bacterianas. A su vez, se realizaron estudios utilizando técnicas biofísicas con la intención de comprender el funcionamiento de esta proteína, al mismo tiempo que se estudiaron dos dominios de la misma con el objetivo de caracterizar sus roles dentro de la proteína. Esto permitió estudiar la relación estructura-función de Hpa1 con mayor detalle. Se determinó que ambos dominios inducen HR en tejidos de plantas no hospedadoras, mientras que la capacidad de formación de fibras y de agregar células bacterianas es particular y propia de la región amino terminal de la proteína. Por otro lado, el gen hrpE perteneciente también al cluster hrp de Xac codifica para la proteína pilina que constituye el Pilus Hrp del SST3. Se estudiaron nuevos roles para esta proteína, determinando los efectos que produce la misma en las plantas. Así se logró determinar que HrpE es reconocida tanto por plantas hospedadoras como no hospedadoras. En el caso de las plantas no hospedadoras, las mismas respondieron desarrollando HR, deposición de calosa y producción de ROS, y un aumento en la expresión de genes relacionados con respuestas de defensa, mientras que en naranja todas esta respuestas fueron significativamente más leves en intensidad. Además, fue encontrada una nueva función para esta pilina promoviendo el priming tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, disminuyendo el grado de infección de Xac y del fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), causante de la enfermedad Mancha o Sarna Bacteriana en plantas de tomate y pimiento. Al mismo tiempo se analizó la factibilidad del uso de anticuerpos contra esta pilina, como estrategia para la obtención de plantas resistentes a la Cancrosis de los Cítricos. De esta forma, se encontró una significativa disminución de los efectos producidos tanto por HrpE recombinante como por Xac y Xcv en plantas de naranja, validando esta estrategia para el futuro desarrollo de plantas resistentes que expresen transgénicamente estos anticuerpos. Las proteínas blanco de naranja encontradas a través del ensayo de doble híbrido en levaduras para HrpE y Hpa1, mostraron una diversa variedad de funciones, entre ellas, se encontraron proteínas cuyos genes se ven inducidos, o forman parte de la defensa, frente a algún estrés tanto biótico como abiótico; proteínas pertenecientes a los mecanismos de degradación de otras proteínas; enzimas involucradas en el metabolismo, ya sea primario o secundario; proteínas relacionadas al ciclo celular; enzimas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis redox de la célula; proteínas de membrana tanto quinasas sensoras como transportadores de iones o azucares; enzimas involucradas en la producción de fitohormonas; y proteínas relacionadas con el reordenamiento y la muerte celular.Ítem Acceso Abierto The dual nature of trehalose in citrus canker disease: a virulence factor for Xanthomonas citri subsp. citri and a trigger for plant defence responses(Oxford University, 2015-03-15) Piazza, Ainelén; Zimaro, Tamara; Garavaglia, Betiana Soledad; Ficarra, Florencia Andrea; Thomas, Ludivine; Marondedze, Claudius; Feil, Regina; Lunn, John E.; Gehring, Chris; Ottado, Jorgelina; Gottig, NataliaXanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is a bacterial pathogen that causes citrus canker in susceptible Citrus spp. The Xcc genome contains genes encoding enzymes from three separate pathways of trehalose biosynthesis. Expression of genes encoding trehalose-6-phosphate synthase (otsA) and trehalose phosphatase (otsB) was highly induced during canker development, suggesting that the two-step pathway of trehalose biosynthesis via trehalose-6-phosphate has a function in pathogenesis. This pathway was eliminated from the bacterium by deletion of the otsA gene. The resulting XccΔotsA mutant produced less trehalose than the wild-type strain, was less resistant to salt and oxidative stresses, and was less able to colonize plant tissues. Gene expression and proteomic analyses of infected leaves showed that infection with XccΔotsA triggered only weak defence responses in the plant compared with infection with Xcc, and had less impact on the host plant’s metabolism than the wild-type strain. These results suggested that trehalose of bacterial origin, synthesized via the otsA–otsB pathway, in Xcc, plays a role in modifying the host plant’s metabolism to its own advantage but is also perceived by the plant as a sign of pathogen attack. Thus, trehalose biosynthesis has both positive and negative consequences for Xcc. On the one hand, it enables this bacterial pathogen to survive in the inhospitable environment of the leaf surface before infection and exploit the host plant’s resources after infection, but on the other hand, it is a tell-tale sign of the pathogen’s presence that triggers the plant to defend itself against infection.Ítem Acceso Abierto The type III protein secretion system contributes to Xanthomonas citri subsp. citri biofilm formation(Springer Nature, 2014-04-18) Zimaro, Tamara; Sgro, Germán Gustavo; Garofalo, Cecilia Graciela; Ficarra, Florencia Andrea; Ottado, Jorgelina; Gottig, Natalia; Thomas, Ludivine; Marondedze, Claudius; Gehring, ChrisBackground: Several bacterial plant pathogens colonize their hosts through the secretion of effector proteins by a Type III protein secretion system (T3SS). The role of T3SS in bacterial pathogenesis is well established but whether this system is involved in multicellular processes, such as bacterial biofilm formation has not been elucidated. Here, the phytopathogen Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) was used as a model to gain further insights about the role of the T3SS in biofilm formation. Results: The capacity of biofilm formation of different X. citri T3SS mutants was compared to the wild type strain and it was observed that this secretion system was necessary for this process. Moreover, the T3SS mutants adhered proficiently to leaf surfaces but were impaired in leaf-associated growth. A proteomic study of biofilm cells showed that the lack of the T3SS causes changes in the expression of proteins involved in metabolic processes, energy generation, exopolysaccharide (EPS) production and bacterial motility as well as outer membrane proteins. Furthermore, EPS production and bacterial motility were also altered in the T3SS mutants. Conclusions: Our results indicate a novel role for T3SS in X. citri in the modulation of biofilm formation. Since this process increases X. citri virulence, this study reveals new functions of T3SS in pathogenesis.Ítem Acceso Abierto XacFhaB adhesin, an important Xanthomonas citri ssp. citri virulence factor, is recognized as a pathogen-associated molecular pattern(BSPP and Wiley, 2016-11-15) Garavaglia, Betiana Soledad; Zimaro, Tamara; Abriata, Luciano Andrés; Ottado, Jorgelina; Gottig, NataliaAdhesion to host tissue is one of the key steps of the bacterial pathogenic process. Xanthomonas citri ssp. citri possesses a non-fimbrial adhesin protein, XacFhaB, required for bacterial attachment, which we have previously demonstrated to be an important virulence factor for the development of citrus canker. XacFhaB is a 4753-residue-long protein with a predicted β-helical fold structure, involved in bacterial aggregation, biofilm formation and adhesion to the host. In this work, to further characterize this protein and considering its large size, XacFhaB was dissected into three regions based on bioinformatic and structural analyses for functional studies. First, the capacity of these protein regions to aggregate bacterial cells was analysed. Two of these regions were able to form bacterial aggregates, with the most amino-terminal region being dispensable for this activity. Moreover, XacFhaB shows features resembling pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), which are recognized by plants. As PAMPs activate plant basal immune responses, the role of the three XacFhaB regions as elicitors of these responses was investigated. All adhesin regions were able to induce basal immune responses in host and non-host plants, with a stronger activation by the carboxyl-terminal region. Furthermore, pre-infiltration of citrus leaves with XacFhaB regions impaired X. citri ssp. citri growth, confirming the induction of defence responses and restraint of citrus canker. This work reveals that adhesins from plant pathogens trigger plant defence responses, opening up new pathways for the development of protective strategies for disease control.Ítem Acceso Abierto Xanthomonas citri ssp. citri requires the outer membrane porin OprB for maximal virulence and biofilm formation(Wiley, 2017-06) Ficarra, Florencia Andrea; Grandellis, Carolina; Galván, Estela M.; Ielpi, Luis; Feil, Regina; Lunn, John E.; Gottig, Natalia; Ottado, JorgelinaXanthomonas citri ssp. citri (Xcc) causes canker disease in citrus, and biofilm formation is critical for the disease cycle. OprB (Outer membrane protein B) has been shown previously to be more abundant in Xcc biofilms compared with the planktonic state. In this work, we showed that the loss of OprB in an oprB mutant abolishes bacterial biofilm formation and adherence to the host, and also compromises virulence and efficient epiphytic survival of the bacteria. Moreover, the oprB mutant is impaired in bacterial stress resistance. OprB belongs to a family of carbohydrate transport proteins, and the uptake of glucose is decreased in the mutant strain, indicating that OprB transports glucose. Loss of OprB leads to increased production of xanthan exopolysaccharide, and the carbohydrate intermediates of xanthan biosynthesis are also elevated in the mutant. The xanthan produced by the mutant has a higher viscosity and, unlike wild-type xanthan, completely lacks pyruvylation. Overall, these results suggest that Xcc reprogrammes its carbon metabolism when it senses a shortage of glucose input. The participation of OprB in the process of biofilm formation and virulence, as well as in metabolic changes to redirect the carbon flux, is discussed. Our results demonstrate the importance of environmental nutrient supply and glucose uptake via OprB for Xcc virulence.