Examinando por Autor "Delmonti, Juliana"

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    Deciphering the evolution of metallo-β-lactamases: A journey from the test tube to the bacterial periplasm
    (American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2022-02-01) López, Carolina; Delmonti, Juliana; Bonomo, Robert A.; Vila, Alejandro J.
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    Estudio de la evolución natural de la carbapenemasa NDM
    (2023) Delmonti, Juliana; Vila, Alejandro J.
    La resistencia a antibióticos es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo. Los carbapenemes son antibióticos de último recurso en la clínica, amenazados por la actividad de las carbapenemasas. Dentro de éstas, NDM es una de las metalo-βlactamasas más diseminadas. La falta de inhibidores clínicos la convierte en un problema sanitario grave. NDM depende de la unión de Zn(II) a su sitio activo para su actividad y estabilidad in vivo. Durante una infección, la respuesta inmune innata del hospedador limita la disponibilidad de Zn(II), reduciendo los niveles periplasmáticos del metal. Como consecuencia, NDM se inactiva, acumulándose como apo-NDM, es decir sin Zn(II) en el sitio activo. Además, apo-NDM es susceptible a degradación por las proteasas periplasmáticas Prc y DegP, perdiendo la capacidad de conferir resistencia. Sin embargo, las variantes clínicas de NDM acumulan sustituciones que optimizan el fenotipo de resistencia en condiciones de escasez de Zn(II), tales como M154L y E152K. La sustitución M154L está presente en el 43% de las variantes, y se ha sugerido que aumenta la afinidad de la enzima por el Zn(II), pero la evidencia experimental en la literatura es confusa. En cambio, la sustitución E152K parece aumentar la estabilidad in vivo de NDM. Hasta el momento se desconocen de qué manera las características bioquímicas y biofísicas inducidas por estas sustituciones impactan en el fenotipo de resistencia. En esta Tesis nos propusimos estudiar los cambios producidos por estas sustituciones claves a nivel bioquímico y estructural. Por medio de estudios bioquímicos en las variantes NDM-1, NDM-4 (M154L), NDM-15 (M154L A233V) y NDM-6 (A233V) determinamos que la sustitución M154L no afecta la actividad catalítica de la enzima, ni la estabilidad térmica de las formas apo y holo (unida a 2 iones Zn(II)), sino que aumenta la afinidad por el Zn(II) en 2 órdenes de magnitud, lo cual favorecería su capacidad de resistir a condiciones de escasez de este metal. Los estudios estructurales revelan que apo-NDM-4 presenta mayor dinámica que apo-NDM-1, lo que resulta en un sitio más ocluido, que podría limitar la disociación del Zn(II), aumentando la afinidad de la enzima por el mismo. La sustitución E152K (presente en NDM-9) estabiliza a la apo-enzima en el periplasma frente a la limitación de Zn(II). Apo-NDM-9 evade la acción de la proteasa Prc, que es activa frente a apo-NDM-1. Demostramos que el residuo K152 forma un puente salino con D223 (ubicado el bucle L10) en apo-NDM-9, que conecta ambas mitades de la enzima y reduce la dinámica del extremo C-terminal. Este impacto en la dinámica proteica impide el reconocimiento de apo-NDM-9 por Prc, lo que resulta en una mayor estabilidad in vivo. La cercanía en la secuencia de las dos sustituciones estudiadas en este trabajo sugiere que la región que contiene la hélice α3 y el bucle L8 (donde se ubican E152K y M154L, respectivamente) puede modular características de la enzima muy diversas como la afinidad por el Zn(II) y la estabilidad de la enzima. En ambos casos, resulta una región clave para la evolución de la carbapenemasa NDM frente a procesos de limitación de metal.
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    Estudios de los Caminos Evolutivos de la Carbapenemasa NDM
    (2022) Zuccato, Francesco Gabriel; Vila, Alejandro J.; Delmonti, Juliana
    Los compuestos β-lactámicos son los antibióticos más utilizados para el tratamiento de infecciones bacterianas en la clínica. En las últimas décadas la aparición de cepas bacterianas multirresistentes ha aumentado, limitando su uso. El principal mecanismo de resistencia es la expresión de β-lactamasas, enzimas que hidrolizan estos antibióticos. La metalo-β-lactamasa de Nueva Delhi (NDM) es una de las más diseminadas por el mundo y de amplio espectro, siendo capaz de hidrolizar antibióticos de último recurso como los carbapenemes. Para lograr esto requiere de dos iones Zn(II) en su sitio activo. En ausencia de estos metales, la proteína no es activa y es proteolizada en el periplasma. La mayoría de las sustituciones en las 41 variantes naturales proveen ventajas adaptativas frente a la limitación de la disponibilidad de Zn(II) durante una infección. Entre las sustituciones más frecuentes, M154L aumenta la afinidad de la proteína por el Zn(II), y A233V estabiliza a la apo-enzima frente a la acción de proteasas. Resultados preliminares sugieren que la sustitución E152K estabiliza la apo-enzima, de manera similar a A233V, pero es menos frecuente y no se ha encontrado en combinaciones con otras sustituciones. En esta tesina evaluamos posibles caminos evolutivos de NDM a fin de entender los mecanismos de adaptación más relevante en su evolución. A tales fines, se estudiaron los efectos de la sustitución E152K sobre las variantesnaturales con las sustituciones A233V y M154L y se exploraron las características moleculares de las variantes NDM-EA, NDM-EM y NDM-EMA en condiciones de limitación de Zn(II) como sucede durante la respuesta innata del hospedador. Todas presentaron ventajas evolutivas al compararlas con NDM-1, mostrando mejor capacidad de proteger a las bacterias en condiciones de limitación de Zn(II). Esta optimización se da por un aumento de la estabilidad in vivo de la forma apo. Sin embargo, la sustitución E152K mostró tener un efecto negativo sobre la afinidad por el Zn(II) en combinación con las sustituciones M154L y A233V. Esto confirma que las sustituciones presentes en las variantes naturales de NDM tienden a estabilizar la proteína frente a la limitación de Zn(II), aumentando la afinidad por el metal o disminuyendo la susceptibilidad frente a proteasas. La menor frecuencia de aparición de la sustitución E152K con respecto a A233V podría deberse a que la primera disminuye la afinidad por el metal.