Examinando por Autor "Cotorruelo, Carlos"
Mostrando 1 - 4 de 4
Resultados por página
Opciones de ordenación
Ítem Acceso Abierto Análisis del perfil de citocinas en pacientes con complicaciones del embarazo : estudio preliminar(Asociación Bioquímica Argentina, 2015-06-14) Pezzarini, Eleonora; Balbi, Bárbara; Trucco Boggione, Carolina; Cotorruelo, Carlos; Bottai, Hebe; Pezzotto, Stella; Daniele, Stella; Arriaga, Sandra Mónica María; Pelusa, H. Fabián; Asociación Bioquímica ArgentinaLa hipertensión gestacional (HG), es una de las entidades obstétricas más frecuentes y, tal vez, la que más repercusión desfavorable ejerce sobre el producto de la concepción y a su vez sobre la madre. La preeclampsia (PE) es una enfermedad multisistémica, de causa desconocida y es una de las principales causas de morbimortalidad materna y perinatal. El hecho de que el sistema inmunitario materno permita la implantación de un embrión sin complicaciones representa una manifestación de tolerancia inmunológica. Se postula que para un desarrollo trofoblástico normal, sería necesaria una expresión de citocinas del tipo Th2. En cambio, si el perfil predominante fuera el Th1, existiría una hostilidad inmunológica hacia el trofoblasto, que traería como consecuencia una disminución del flujo sanguíneo a la unidad feto-placentaria, isquemia y finalmente necrosis. El objetivo del trabajo fue analizar la expresión de citocinas en mujeres con trastornos del embarazo tales como la HG y la PE y analizar la correlación entre estas citocinas y la presencia de las patologías mencionadas. Para ello se trabajó con un grupo de pacientes con diagnóstico de HG (n=6), de PE (n=3) y como grupo control (GC) se incluyeron embarazadas sin patologías asociadas (n=10). Todas provenían del Servicio de Ginecología y Obstetricia del Hospital Provincial del Centenario y firmaron el consentimiento informado. Se excluyeron aquellas pacientes que presentaban hipertensión arterial primaria, evidencias clínico-bioquímicas de hipertensión secundaria, diabetes, insuficiencia renal, proteinuria franca (>1g/24 h) o infección urinaria. Se analizó la expresión de las siguientes citocinas con el fin de establecer el patrón de respuesta, Th1 mediante la expresión de interferón gamma (IFNγ) y Th2 mediante la expresión de interleucina-4 (IL-4). El protocolo de trabajo incluyó los siguientes pasos: 1) Extracción sanguínea utilizando EDTA como anticoagulante, 2) Separación de las células mononucleares utilizando gradiente de Ficoll-Hypaque, 3) Extracción del ARN, 4) Comprobación de la integridad del ARN, 5) Retrotranscripción, 6) Integridad del ADNc y 7) Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. La determinación de las concentraciones relativas de IFNγ e IL-4, se efectuó utilizando el gen de la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa como gen de referencia. Los resultados obtenidos [mediana (rango)] para IFNγ en las embarazadas patológicas y en el GC fueron respectivamente: 0,55 (0,14-23,74) y 0,96 (0,12-14,23) y para IL-4: 0,88 (0,17-3,44) y 2,5 (0,27-18,5). No hubo diferencia significativa en los niveles de IL-4 ni de IFNγ entre las mujeres con embarazo patológico y el GC (p=0,076 y p=0,438; respectivamente). El coeficiente de correlación de rangos de Spearman entre ambas variables fue -0,100 (p=0,77) para las embarazadas patológicas y -0,09 (p=0,78) para el GC. Se concluye que, en la muestra analizada, no se evidencia un desequilibrio entre los perfiles Th1 yTh2 que permita adjudicarle un rol patogénico en las complicaciones hipertensivas del embarazo.Ítem Embargo Caracterización molecular de haplotipos Rh variantes. Implicancia en medicina transfusional(2023) Principi, Cintia Soledad; Cotorruelo, Carlos; Trucco Boggione, CarolinaEl sistema Rh posee gran importancia clínica debido a la inmunogenicidad de sus antígenos, y a la participación de sus anticuerpos en la patogénesis de la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de reacciones hemolíticas transfusionales y de algunas anemias hemolíticas autoinmunes (8, 73). El locus RH está compuesto por dos genes homólogos denominados RHD y RHCE, que codifican las proteínas transmembranales eritrocitarias RhD y RhCE, respectivamente (180). Este sistema presenta gran variabilidad alélica, que se traduce en fenotipos con expresión parcial o débil de los antígenos y en deleciones parciales o totales de las proteínas (15). El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas muestran con los antisueros monoclonales restringe la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. El conocimiento de las bases genéticas del sistema Rh permitirá implementar estrategias moleculares útiles para identificar inequívocamente el alelo responsable del fenotipo Rh. En este trabajo de Tesis hemos investigado los eventos genéticos responsables de la variabilidad en la expresión de los antígenos Rh y analizado la asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE. Además, hemos validado una estrategia molecular para la detección de sustituciones, insersiones y deleciones nucleotidicas, presencia/ausencia y variación del número de copias de exones de los genes RH para la identificación de fenotipos con genotipo desconocido. En este trabajo de Tesis se analizaron las bases moleculares responsables de alteraciones en la expresión de los antígenos D y E encontradas en un donante de sangre y su familia. Mediante diferentes estrategias de biología molecular se han elucidado las bases genéticas que subyacen en la expresión aberrante de estos antígenos. Los resultados obtenidos mostraron que el donante y sus dos hijos son portadores del haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHCE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. Para confirmar este hallazgo, se estudiaron posteriormente 17 muestras de ADN de donantes portadores del alelo RHD*DEL43 y su asociación con la variante alélica RHCE*ce.37. Este estudio permitió identificar el haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37 en el 64,71% de las muestras estudiadas, demostrando una fuerte asociación entre ambas variantes RH. Posteriormente, se estudió la asociación entre los alelos RHD*D débil tipo 1 en R0 y RHD*D débil tipo 4, hallados con alta prevalencia en individuos con fenotipo D variante de nuestra población (104, 164), con los polimorfismos más frecuentemente encontrados en variantes alélicas RHCE (c.48C en el exón 1 y c.733G en el exón 5). Se estudiaron 32 muestras de ADN provenientes de individuos con genotipo RHD*D débil tipo 1 en R0 (n=15) y de individuos con fenotipo Dccee (n=17 como grupo control) y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados obtenidos mostraron que en el 100% de las muestras portadoras del alelo RHD*D débil tipo 1 en R0 y en el 76,47% de las muestras con fenotipo Dccee se identificaron los polimorfismos c.48C y c.48G. Estos estudios moleculares sugieren un desequilibrio de ligamiento entre los alelos RHD*D débil tipo 1 y el alelo RHD normal cuando se encuentran en haplotipo R0 con la variante alélica RHCE*ce (48C). En cuanto al estudio llevado a cabo para la detección del polimorfismo c.733G, los resultados moleculares sugieren que no existe asociación entre las variantes RHD analizadas y el alelo RHCE*ce (733G). En una etapa posterior, se estudiaron 61 muestras RHD*D débil tipo 4 y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados de este análisis permitieron determinar que hay una asociación del 86,89% entre el alelo RHD*D débil tipo 4 y los polimorfismos c.48C, c.733G. Con el objetivo de establecer si los polimorfismos c.48C y c.733G presentes en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 se encuentran en cis, formando parte de un alelo RHCE*ce(c.48C, c.733G) (haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G)) o formando parte de los haplotipos RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.48C) o RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.733G) en trans con los haplotipos RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.733G) o RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.48C), respectivamente, se analizó la presencia de los SNVs c.48C y c.733G en 304 muestras de ADN con una deleción homocigota del gen RHD. Este estudio mostró una baja asociación entre el alelo RHD*01N.01 con los polimorfismos c.48C y c.733G. El 2,30% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.733G y el 2,96% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.48C. Ninguna de las muestras analizadas fue portadora de ambos polimorfismos concomitantemente. Estos hallazgos sugieren que en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 los polimorfismos c.48C y c.733G se encuentran en cis formando el haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G). Para evaluar la presencia de otros polimorfismos en el exón 5 del gen RHCE, se realizaron estudios de secuenciación en muestras portadoras del haplotipo RHD*01N.01-RHCE*ce(733G). Los resultados mostraron que este polimorfismo fue detectado en estado heterocigota en todas las muestras analizadas, sugiriendo que el alelo RHCE hallado es RHCE*ceVS.01. Los resultados obtenidos en los estudios de asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE permitieron detectar desequilibrios de ligamiento que involucran a las variantes RHD*DEL43, RHD*D débil tipo 1 y RHD*D débil tipo 4 con alelos RHCE responsables de expresiones alteradas de los antígenos c, E y e. La identificación de variantes RHCE por métodos moleculares permite superar las limitaciones de las técnicas serológicas convencionales que no detectan expresiones aberrantes de los antígenos c, E y e en muestras que portan una copia normal del gen RHCE en trans. La detección de estos polimorfismos del gen RHCE por métodos moleculares permite prevenir eventos de aloinmunización cuando las variantes RHCE*ce.37 y RHCE*ce (48C, 733G) se encuentran en trans con los alelos normales RHCE*Ce, RHCE*Ce o RHCE*CE. En este trabajo de Tesis se validó una nueva estrategia molecular (PCR multiplex cuantitativa de fragmentos cortos fluorescentes: PCR-QMPSF) para investigar el número de copias de todos los exones, tanto del gen RHD como RHCE. Inicialmente se estudió un grupo de muestras portadoras de genes normales y genes híbridos D-CE con genotipos conocidos para validar su utilidad y robustez. A través de esta estrategia logramos caracterizar 4 variantes alélicas RHD, identificando 3 alelos nulos, RHD-RHCE(3-9)-D (n=2), RHD*01N.07 y un alelo D parcial RHD*DVI tipo 4, de una forma mucho más rápida, menos laboriosa y disminuyendo el error asociado al operador. Sin embargo, se trata de una metodología costosa que debe ser empleada criteriosamente. Esta estrategia presenta muchas ventajas, incluido el hecho de que la reacción se lleva a cabo en un formato de tubo cerrado, reduciendo así la exposición química de los operadores a compuestos potencialmente nocivos. El método aprovecha el etiquetado fluorescente universal, que utiliza un solo cebador conjugado con marcación fluorescente para etiquetar todos productos de PCR, contribuyendo así a reducir el coste de los reactivos. Finalmente hemos investigado las bases moleculares responsables de la expresión alterada de los antígenos RhCE en 4 donantes de sangre, logrando caracterizar la estructura molecular de los alelos responsables. Se estudió un grupo familiar donde se observó una discrepancia en la herencia de los antígenos RhCE. Los resultados moleculares obtenidos han permitido demostrar la presencia de un nuevo haplotipo nulo RHD*08N.01- RHCE*01.16(807G). Cabe señalar que tanto los alelos RHD como RHCE en este haplotipo son silenciados por el mismo SNV c.807T>G, posiblemente como consecuencia de la recombinación homóloga entre las secuencias RHD y RHCE. Esta sustitución nucleotídica es responsable de la generación de un codón de terminación prematuro y proteínas Rh truncas que no se integran en la membrana del eritrocito. Estudios previos (118, 107, 178, 179) han reportado que el mismo codón de terminación generado por la mutación en la posición nucleotídica 807 es responsable de 9 alelos RH silentes (8 RHD y un alelo RHCE). Teniendo en cuenta todos estos hallazgos resulta lógico suponer que esta posición en la secuencia de ADN presenta una inestabilidad inherente susceptible a adquirir mutaciones debido a una alta tendencia a la conversión génica o a sustituciones de nucleótidos simples. El análisis de segregación familiar mostró que este haplotipo se heredó por vía materna. Por otro lado, se investigó la presencia de la inserción de 4 pb en el exón 8 del gen RHD en muestras portadoras del gen RHD*08N.01, previamente genotipificadas en nuestro laboratorio. La estrategia QMPSF permitió demostrar que en nuestra población todas las variantes RHD*08N.01 halladas muestran un desplazamiento de 4pb en el exón 8 del gen RHD, lo cual constituye un nuevo polimorfismo que podría ser utilizado para la caracterización del pseudogen RHDΨ. Finalmente, se identificaron los mecanismos moleculares responsables de fenotipos con deleción parcial de los antígenos RhCE en 3 donantes. En una muestra se halló una mutación puntual (c.659G > A) que genera un codón de terminación prematuro y una proteína trunca RhCE incapaz de integrarse en la membrana del eritrocito (fenotipo D--). En las otras dos muestras estudiadas se detectaron nuevos alelos híbridos RHCE-D-CE responsables no solo de los fenotipos D- - y Dc- sino también de la sobreexpresión de antígeno D y de la expresión de un antígeno c variante, respectivamente. En este trabajo de Tesis evidenció que distintos mecanismos moleculares pueden ser responsables de un mismo fenotipo con deleción parcial de los antígenos RhCE (D--). En todos los casos estudiados se brindó asesoramiento genético a los donantes en caso de requerir transfusiones o cursar embarazos a lo largo de su vida. Las estrategias moleculares diseñadas en este trabajo de Tesis permitieron profundizar los conocimientos sobre los eventos genéticos responsables de la expresión variante de los antígenos del sistema Rh. Hemos demostrado que los estudios serológicos no son suficientes para identificar todas las variantes antigénicas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis establecen la importancia del estudio del polimorfismo molecular del locus RH, para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RH y optimizar la selección de unidades hemocompatibles en los servicios de medicina transfusional.Ítem Acceso Abierto Estudio de la variabilidad genética y fenotípica del sistema RH. Implicancia en medicina transfusional.(2020) Mufarrege, Nicolás Daniel; Cotorruelo, CarlosEn la membrana del glóbulo rojo (GR), los polipéptidos Rh forman un complejo macromolecular con varias proteínas transmembranales, entre ellas la Banda 3. Debido a que esta última está involucrada en los cambios que ocurren durante la senescencia eritrocitaria, los polipéptidos Rh podrían participar también en este proceso. Por otro lado, el sistema Rh posee gran importancia clínica debido a la inmunogenicidad de sus antígenos, y a la participación de sus anticuerpos en la patogénesis de la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de reacciones hemolíticas transfusionales y de algunas anemias hemolíticas autoinmunes. Este sistema presenta gran variabilidad alélica, que se traduce en fenotipos con expresión parcial o débil de los antígenos y en deleciones parciales o totales de las proteínas. Considerando el gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas muestran con los antisueros monoclonales, la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación presenta limitaciones. El conocimiento de las bases genéticas del sistema Rh en nuestra población permitirá implementar estrategias moleculares útiles para identificar inequívocamente el alelo responsable del fenotipo Rh. En este trabajo de tesis se analizaron 560 muestras con fenotipo D negativo portadoras de los antígenos C y/o E y 397 muestras con expresión débil del antígeno D, obtenidas a partir de sangre periférica de donantes voluntarios sanos y de pacientes, provenientes de distintos servicios transfusionales de nuestro país. En todas las muestras se realizaron estudios serológicos y moleculares. En 98 de las 560 muestras con fenotipo D negativo C y/o E positivo analizadas fueron identificados alelos RHD silentes y DEL. Estos hallazgos indican que el fenotipo D negativo no se genera exclusivamente por una deleción homocigota del gen RHD. Un total de 239 muestras con fenotipo D variante (60,23%) expresaron alelos RHD*D débil tipo 1, 2 y 3, indicando que los individuos portadores de estas variantes no son susceptibles de desarrollar aloinmunizaciones anti-D. Estas observaciones demuestran la relevancia de la caracterización molecular del fenotipo D variante ya que permite implementar en los servicios de sangre un uso adecuado de unidades D negativo y en obstetricia una administración más racional de la inmunoprofilaxis anti-D en embarazadas. Los análisis de secuenciación permitieron la identificación de nuevos polimorfismos evidenciando la variabilidad alélica del sistema Rh. Se estudió una paciente que presentó un fenotipo Rhmod, detectándose niveles reducidos de los antígenos Rh e identificándose el alelo nuevo RHAG*M.12. Se analizó un paciente con un autoanticuerpo con especificidad relativa anti-D, que resultó portador de la variante alélica RHD*DEL43. Se investigó una gestante con un aloanticuerpo anti-D, la cual presentó el alelo RHD*DBT2. Conjuntamente estos hallazgos valorizan la genotipificación RHD, al detectar los polimorfismos que caracterizan los distintos fenotipos D cuando los análisis serológicos no son concluyentes. El estudio de la expresión de los epitopes D en GRs jóvenes y senescentes de adultos y de neonatos con fenotipo D positivo, mostró que era mayor en éstos últimos. Además, se observó la participación de IgG en la senescencia eritrocitaria de los GRs neonatales. Estos hallazgos permitieron concluir que tanto la proteina RhD como la IgG autóloga están asociadas a las modificaciones en la membrana que sufre el GR durante su envejecimiento.Ítem Acceso Abierto Estudio de las bases moleculares responsables de los fenotipos D negativo y D variante del sistema Rh en la población argentina : Importancia clínica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-17) Trucco Boggione, Carolina; Cotorruelo, CarlosEl sistema Rh es el grupo sanguíneo más complejo y polimórfico de la membrana eritrocitaria. Presenta un gran interés clínico en Medicina Transfusional, Obstetricia y Hematología, debido a la participación de sus anticuerpos en los procesos de destrucción inmune de los glóbulos rojos. Los antígenos Rh desempeñan un papel central en las reacciones hemolíticas transfusionales, en la inmunización de pacientes politransfundidos, en la patogénesis de la Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal y en algunas Anemias Hemolíticas Autoinmunes. El locus RH está compuesto por dos genes denominados RHD y RHCE que codifican para las proteínas transmembranales RhD y RhCE portadoras de los antígenos D y C, c, E, e, respectivamente. La presencia o ausencia del gen RHD en el ADN humano determina las bases moleculares del polimorfismo asociado a los fenotipos D positivo y D negativo. Los individuos D positivo poseen uno o dos genes RHD por célula; mientras que el fenotipo D negativo resulta de la ausencia del gen RHD, siendo las personas D negativo homocigotas para la deleción de este gen. Sin embargo, se ha reportado que existen numerosas variantes alélicas responsables de un fenotipo D negativo que dan origen a proteínas RhD que no expresan los epitopes del antígeno D o no se ensamblan en la membrana eritrocitaria. Además, se han descripto fenotipos D variante (Dvar) generados por distintos eventos moleculares que conducen a una expresión alterada de la proteína RhD. Dentro del fenotipo Dvar, las variantes cualitativas o fenotipo D parcial se caracterizan por la ausencia de algunos epitopes D mientras que las variantes cuantitativas, fenotipo D débil, presentan una expresión disminuida de todos los epitopes D. Los individuos con fenotipo D parcial pueden desarrollar aloanticuerpos anti-D hacia los epitopes que no poseen si son desafiados con eritrocitos D positivo. Por el contrario, las personas con fenotipo D débil no son susceptibles de desencadenar eventos de aloinmunización. Debido a la incapacidad de los métodos serológicos para discriminar entre fenotipo D parcial y D débil, los pacientes con un fenotipo Dvar deben ser considerados D negativo para transfusiones o embarazos. Por otro lado, el fenotipo DEL se caracteriza por presentar una expresión mínima del antígeno D en la membrana del glóbulo rojo. Debido a la dificultad para identificar el fenotipo DEL mediante las técnicas serológicas convencionales, la mayoría de los donantes portadores de estas variantes son tipificados erróneamente como D negativo, con el riesgo potencial de inducir una aloinmunización en receptores D negativo. El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas presentan con los antisueros monoclonales restringen la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. Debido a la elevada variabilidad genética interpoblacional del sistema Rh, es de fundamental importancia establecer el polimorfismo molecular del locus RH en individuos de nuestro país con miras a implementar un abordaje inmunohematológico basado en estudios moleculares. En este trabajo de Tesis hemos investigado las bases genéticas del locus RH en nuestra población para aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares responsables del fenotipo D negativo y fenotipos con expresión débil del antígeno D. Se analizaron 1120 muestras de donantes que concurrieron a bancos de sangre y efectores de salud de Tucumán, Córdoba, Rosario, La Plata y CABA. Dentro de este grupo, se estudiaron 796 muestras con fenotipo D negativo portadoras de los antígenos C y/o E y 324 muestras con fenotipo D variante. Además, se investigó la presencia del marcador genético RHDΨ, característico de individuos de la etnia africana, en 221 muestras con fenotipo dccee provenientes de Tucumán y 1200 de Rosario, y el alelo DI*A, marcador genético de la etnia amerindia en 178 muestras de Tucumán y 150 provenientes de Rosario. En todas las muestras se realizaron estudios serológicos y moleculares. Se evaluó la presencia de los antígenos del sistema Rh mediante técnicas de hemaglutinación. Los fenotipos DEL fueron identificados por ensayos de adsorción y elución. Además, se realizaron estudios de los niveles de expresión del antígeno D por citometría de flujo. Se investigó la presencia del gen RHD mediante una estrategia de PCR multiplex basada en el polimorfismo de longitud del intrón 4 y en la presencia de una secuencia específica en la región 3' no codificante del gen RHD. Se diseñaron diferentes estrategias moleculares de PCR para caracterizar los mecanismos moleculares responsables de los fenotipos D observados. También se utilizaron técnicas de microarreglos de ADN y secuenciación para definir nuevos polimorfismos. Los estudios de detección del gen RHD por la estrategia de PCR multiplex realizados en este trabajo de Tesis permitieron identificar la presencia de fragmentos del gen RHD en 133 (16,71%) de las 796 muestras con fenotipo D negativo estudiadas (muestras D-/RHD+). Estos resultados mostraron que el fenotipo D negativo no es generado sólo por un evento de deleción del gen RHD en individuos de nuestra población. A través de las distintas estrategias moleculares utilizadas en este trabajo se caracterizaron variantes RHD nulas y DEL generadas por eventos de conversión génica entre alelos RHD y RHCE, deleción e inserción de nucleótidos, mutaciones de cambio de sentido y mutaciones sin sentido en muestras D negativo C/E positivo. Los estudios realizados detectaron 98 individuos (12,31%) portadores de alelos RHD nulos y 19 (2,39%) portadores de alelos DEL. Dentro de este grupo se caracterizaron las variantes alélicas no reportadas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10), RHD(329T>C)-CE(3-9)-D, RHD(581insG) y RHD(1001T>A) responsables de un fenotipo D negativo y el alelo RHD*1248insG que origina un fenotipo DEL. Se observó que la prevalencia de individuos portadores del nuevo alelo nulo RHD*581insG, responsable de la generación de la una proteína RhD truncada que no expresa epitopes D en la membrana eritrocitaria, fue significativamente mayor en las muestras provenientes de Tucumán que en las del resto de las regiones analizadas. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se analizó la distribución del marcador genético DI*A, característico de la etnia amerindia con ascendencia asiática, en muestras provenientes de Tucumán y de Rosario. Los resultados mostraron una proporción significativamente mayor de individuos portadores de la variante DI*A en muestras de Tucumán, sugiriendo un aporte superior de la etnia amerindia a esta población. Considerando que la variante RHD*581insG no ha sido reportada en poblaciones caucásicas europeas, africanas ni asiáticas y que fue detectada con una alta prevalencia en una región donde el aporte amerindio al acervo genético de la población es mayor que en otras áreas geográficas, el nuevo alelo RHD*581insG podría asociarse a la etnia amerindia. Por otro lado, la variante alélica híbrida RHD-CE-Ds, característica de individuos de la etnia africana, fue detectada en el 43,61% de las muestras D-/RHD+ de todas las regiones estudiadas, siendo Tucumán la región con el mayor porcentaje observado. Además, los estudios de secuenciación permitieron caracterizar los mecanismos moleculares responsables del alelo DEL RHD*46C en muestras con expresión del antígeno E. Esta variante alélica fue detectada con mayor prevalencia en muestras provenientes de Rosario y Tucumán. En el grupo de muestras con fenotipo D negativo C/E positivo se detectaron también 15 portadoras del alelo híbrido RHD-CE(3-9)-D. En 7 de estas muestras se identificó el SNP característico del alelo RHD*DVII. Estos hallazgos permiten suponer que la nueva variante híbrida RHD(329T>C)-CE(3-9)-D es producto de una conversión génica entre los alelos RHD*DVII y RHCE*Ce. Debido a que ambas variantes son características de individuos caucásicos, los resultados sugieren que el nuevo alelo surge del aporte europeo a la población de nuestro país. Por otro lado, en este trabajo de Tesis se caracterizaron los eventos moleculares responsables de la generación de las nuevas variantes alélicas RHCE(1-2)-RHD(3361_371del11-10) y RHD*1001A, responsables de un fenotipo D negativo. Hemos demostrados por estudios de adsorción elución que ambas variantes codifican para un polipéptido RhD aberrante y no expresan epitopes D. Estos nuevos alelos fueron incorporados al grupo de las variantes RHD nulas. Además, se identificó una muestra portadora del nuevo alelo RHD*1248insG responsable de un fenotipo DEL. Esta variante alélica genera una proteína RhD de mayor tamaño. Estudios de adsorción-elución permitieron detectar cantidades mínimas del antígeno D en la membrana eritrocitaria. Estos hallazgos sugieren que la proteína RhD aberrante sería capaz de integrarse en la membrana del glóbulo rojo y expresar epitopes D. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demuestran la importancia de conocer la variabilidad alélica que subyace en el locus RH de individuos de nuestra población para desarrollar estrategias de genotipificación RHD que disminuyan la posibilidad de obtener resultados falsos positivos. El diseño de estudios moleculares que incluyan la caracterización de alelos RHD nulos optimizará el diagnóstico prenatal no invasivo del genotipo RHD, asegurando una estricta correlación entre el genotipo y el fenotipo fetal. Además, el conocimiento de las bases moleculares de los alelos DEL asociados a los diferentes grupos étnicos resulta fundamental para desarrollar estrategias de genotipificación en individuos D negativo. En este trabajo de Tesis hemos identificado un 2,39% de individuos portadores de alelos DEL. Estos hallazgos demuestran la importancia de implementar estrategias moleculares en las muestras D negativo C/E positivo para detectar polimorfismos responsables de fenotipos aparentes D negativo capaces de generar una aloinmunización en receptores D negativo. Por otro lado, hemos investigado los mecanismos moleculares del polimorfismo del locus RH en individuos portadores de variantes alélicas RHD responsables de fenotipos con expresión débil del antígeno D en nuestra población. Utilizando estrategias de biología molecular se identificaron alelos D parcial generados por conversión génica entre alelos RHD y RHCE o por SNPs y alelos D débil producto de mutaciones de cambio de sentido. Debido a la dificultad para discriminar serológicamente a las variantes cualitativas, actualmente los pacientes portadores de un fenotipo Dvar se consideran en riego de desarrollar una inmunización anti-D y por lo tanto, son tratados como D negativo para transfusiones o embarazos. Sin embargo, numerosas evidencias clínicas han demostrado que individuos portadores de los alelos D débil tipo 1, 2 y 3 no son susceptibles de aloinmunización anti-D ante una exposición a glóbulos rojos D positivo. Los estudios moleculares de las muestras con fenotipo Dvar mostraron que un 58,02% de los individuos resultaron portadores de alelos D débil tipo 1, 2 o 3. Los resultados indican que más del 60% de los individuos pertenecientes a las ciudades de la región central del país presentaron una expresión aberrante del antígeno D producto de estas variantes alélicas. Sin embargo, en Tucumán la distribución fue menor al 37%. Los análisis estadísticos indicaron que la probabilidad de encontrar un individuo portador de estos alelos en las muestras provenientes de Tucumán fue significativamente menor que para las otras 4 ciudades analizadas donde esta proporción no mostró diferencias significativas. El predominio de alelos D débil tipo 1, 2 y 3, característicos de caucásicos, indicaría un mayor aporte de europeos al acervo genético de la población de la región central del país. La implementación de estrategias moleculares que permitan detectar estas variantes en pacientes que presentan un fenotipo Dvar permitirá optimizar el uso de las escasas unidades D negativo disponibles en los servicios de Medicina Transfusional y reservarlas exclusivamente para los pacientes que se encuentran en riesgo real de desarrollar una respuesta aloinmune hacia el antígeno D. Además, en el grupo de muestras con fenotipo Dvar se caracterizaron los mecanismos moleculares responsables de variantes alélicas D parcial. Los resultados obtenidos mostraron una alta prevalencia de individuos portadores de alelos RHD parcial RHD*DVI (4,63%). Debido a que estas variantes alélicas generan una proteína RhD que carece de algunos epitopes D, los individuos portadores de estos alelos son susceptibles de desarrollar aloinmunización anti-D. La caracterización molecular de las variantes cualitativas en los servicios de Medicina Transfusional de nuestra población evitará posibles incompatibilidades Rh. Por otro lado, se identificaron variantes genéticas RHD producto de mutaciones de cambio de sentido no reportadas. Uno de los nuevos alelos identificados fue registrado y denominado D débil tipo 93 por la Sociedad Internacional de Transfusión Sanguínea (ISBT). Cabe destacar que, de las 31 muestras portadoras de la nueva variante hallada en este trabajo de Tesis, 20 (64,52%) corresponden a donantes provenientes de Tucumán. Teniendo en cuenta que el marcador genético DI*A demostró una mayor influencia amerindia en la región norte del país, la presencia de este alelo podría atribuirse al aporte de esta etnia al acervo genético de la población tucumana. Además, se identificaron 4 nuevas variantes alélicas RHD*325G, RHD*763A, RHD*764A y RHD*911A. Las sustituciones aminoacídicas generadas por estos SNPs provocarían alteraciones en el plegamiento de la proteína RhD que modificarían el correcto ensamblaje del polipéptido RhD en el complejo Rh alterando la expresión de los epitopes D. La discriminación entre variantes cuantitativas y cualitativas es de fundamental importancia en los bancos de sangre para optimizar la compatibilidad transfusional y garantizar la provisión de sangre segura, y en Obstetricia para definir estrategias de intervención médica en las embarazadas. Los hallazgos obtenidos en este trabajo de tesis sobre los mecanismos genéticos responsables de la variabilidad alélica del locus RH en la población argentina, tendrán su correlato en la implementación de estrategias moleculares como herramientas de laboratorio para la asignación precisa e inequívoca de las variantes antigénicas de importancia clínica. Teniendo en cuenta los estudios sobre el polimorfismo molecular del locus RH en nuestra población realizados en este trabajo de Tesis, se diseñó y evaluó un protocolo de genotipificación RHD fetal no invasivo con el objetivo de implementar a futuro una estrategia que contribuya al diagnóstico de la EHFN en embarazadas aloinmunizadas con anti-D y que permita optimizar el uso de la inmunoprofilaxis en mujeres D negativo no sensibilizadas. Considerando la alta prevalencia de alelos RHD silentes y DEL en nuestra población, el diseño de la estrategia de genotipificación prenatal debe tener en cuenta la variabilidad alélica del locus RH para asignar un correcto fenotipo. El algoritmo diseñado en este trabajo propone el estudio del ADN genómico materno para detectar mujeres embarazadas portadoras de alelos RHD y el análisis del ADN genómico paterno en aquellas situaciones donde los resultados obtenidos en el estudio del ADN libre por PCR en tiempo real no son concluyentes. Se realizaron estudios serológicos y moleculares en la sangre de los recién nacidos para correlacionar con los hallazgos moleculares obtenidos en el ADN libre con el fenotipo D eritrocitario de los neonatos. Los resultados obtenidos permitieron asignar el genotipo RHD fetal en el 98,99% de las muestras de plasma materno estudiadas. La correlación entre los resultados moleculares y serológicos mostró que la estrategia de genotipificación RHD prenatal presenta una sensibilidad del 100% al no obtener resultados falsos negativos y una especificidad del 98,81% al detectarse sólo un falso positivo, debido a la presencia de una variante alélica responsable de un fenotipo D negativo. El protocolo diseñado para la detección del gen RHD en ADN fetal libre en plasma materno demostró ser una herramienta útil para la determinación del estatus D del feto en nuestra población. La correcta genotipificación RHD prenatal permitirá diagnosticar fetos en riesgo real de EHFN y definir estrategias de administración de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D exclusivamente a embarazadas cuyos fetos son D positivo.