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Examinando (FBIOyF) Posgrado por Autor "Alvarez, María de Luján"
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Ítem Embargo Estrategias de combinación de citoquinas con nutracéuticos para el tratamiento del carcinoma hepatocelular: suplementación con δ-tocotrienol o quercetina a una terapia con interferon α-2b(2021) Lucci, Alvaro; Carrillo, María Cristina; Alvarez, María de LujánEl carcinoma hepatocelular (HCC) es la tercera causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo, representando el 70-85% de todos los cánceres de hígado. El interferón α (IFN α) se ha utilizado históricamente para evitar la progresión del daño hepático, así como para la prevención de la progresión del HCC en pacientes con hepatitis B o C crónica. Algunos estudios informaron una fuerte actividad antitumoral de IFN α y una mejora en la tasa de supervivencia de pacientes con HCC cuando se administra en combinación con otras terapias de apoyo. Los nutracéuticos son alimentos de origen natural que proveen beneficios medicinales o saludables. Dentro de los mismos se encuentran los tocotrienoles, isómeros de la vitamina E, y la quercetina, el flavonoide más abundante procedente del metabolismo secundario de los vegetales. El δ-tocotrienol presenta, entre todas las isoformas naturales de la vitamina E, las actividades antiproliferativas más potentes contra varios tipos de cáncer, in vitro e in vivo; también presenta la mayor citotoxicidad en células cancerígenas y es el más antiangiogénico. Por otro lado, la quercetina tiene efectos quimiopreventivos en modelos animales de hepatocarcinogénesis, y se evidenció que posee propiedades antiangiogénicas in vitro e in vivo, como también capacidades antiproliferativas. En base a esto, se decidió estudiar la suplementación con δ-tocotrienol o quercetina a una terapia con IFN α y evaluar si existe algún efecto beneficioso entre estos compuestos en el tratamiento del HCC, utilizando diferentes modelos experimentales in vitro, y analizando el posible mecanismo implicado. Se utilizaron 2 líneas celulares: SK-HEP-1 y Huh7, ambas de HCC humano, a las cuales se les aplicaron los tratamientos individuales con IFN α-2b (grupo IFN), δ-tocotrienol (grupo E) y quercetina (grupo Q) y posteriormente se realizaron las combinaciones, IFN α + δ- tocotrienol (grupo IE) y IFN α + quercetina (grupo IQ). Las dosis utilizadas fueron: 10000 UI/ml y 20000 UI/ml de IFN α para las células SK-HEP-1 y Huh7 respectivamente, 25 uM de δ-tocotrienol para ambas células y 12,5 uM de quercetina para las células SK-HEP-1. Se evaluó el impacto de los tratamientos individuales y combinados sobre la viabilidad, migración e invasión celular. Ambas combinaciones resultaron ser beneficiosas, disminuyendo dichos procesos significativamente respecto a cada tratamiento individual. A dichos estudios se sumaron el análisis de los cambios en la expresión de las proteínas que actúan como reguladores críticos para el destino de las células cancerosas, como el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), y las metaloproteinasas de matriz MMP- 7 y MMP-9, las cuales disminuyeron cuando las células se trataron con las combinaciones de los compuestos en estudio. Luego se demostró que los compuestos IFN α y δ-tocotrienol aumentaron la apoptosis a través de la vía mitocondrial en células SK-HEP-1 y Huh7, tanto individualmente como cuando se combinaron. Por otra parte, la quercetina no aumentó la apoptosis en células SK Hep-1; sin embargo, cuando se combinó con IFN α el aumento de la muerte celular por apoptosis fue significativamente mayor respecto al tratamiento individual. Con el fin de estudiar los mecanismos implicados en los efectos observados, se demostró que la combinación de IFN α con δ-tocotrienol actúa a través de la modulación de la vía Erk de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), de la generación de especies reactivas del oxígeno (EROs), e induce cambios en la expresión de la vía p38/MAPK y Notch. Por otro lado, la combinación de IFN α con quercetina actúa a través de la vía p38/MAPK en combinación con la generación de EROs. Por último, se evaluó el impacto de los tratamientos individuales y combinados sobre la angiogénesis, utilizando el modelo in vivo de la membrana corioalantoidea de pollo, demostrando que ambos tratamientos combinados producen una disminución en la formación de vasos sanguíneos nuevos, siendo esta disminución de mayor magnitud a la observada con los tratamientos individuales. En resumen, demostramos que tanto la suplementación con δ-tocotrienol como con quercetina a una terapia con IFN α potencia los efectos antitumorales de la citoquina contra las células de HCC, reduciendo la proliferación celular, la invasividad, la angiogénesis y aumentando la muerte celular apoptótica. En este sentido, un enfoque de tratamiento que utilice inmunoquímicos junto con productos naturales, como los utilizados en nuestro estudio, podría contribuir a establecer nuevas propuestas terapéuticas para el tratamiento del HCC.Ítem Acceso Abierto Rol de los leucotrienos como mediadores de la regeneración hepática posterior a una hepatectomía parcial. implicancia de la inhibición de la 5-lipooxigenasa(2020) Lorenzetti, Florencia; Alvarez, María de LujánEl hígado tiene la capacidad inigualable de volver a crecer luego de la pérdida de tejido, ya sea por lesiones tóxicas, infecciones virales o traumas. Mediante un fenómeno de hiperplasia compensatoria, el hígado recupera la masa perdida manteniendo el funcionamiento óptimo del organismo. Esta característica, conocida como regeneración hepática, permite el trasplante de hígado a partir de donantes vivos y la resección de tumores hepáticos primarios y metastásicos. Además, este proceso ayuda a explicar cómo responde el órgano frente a un daño tóxico por sobredosis de alcohol y drogas, o por infecciones como las hepatitis virales. Un mejor conocimiento de las moléculas que cooperan para iniciar, sostener y completar la regeneración hepática es necesario para la comprensión de las mencionadas situaciones clínicas en las cuales la regeneración del hígado puede fallar o ser deficiente, lo que posibilita, a su vez, establecer mejores estrategias terapéuticas. Los leucotrienos (LT) son una familia de lípidos eicosanoides producidos por leucocitos a partir del ácido araquidónico (AA). La enzima 5-lipooxigenasa (5-LOX) es la enzima central en la síntesis de los LT. Estas moléculas señalizadoras poseen funciones proinflamatorias. En los últimos años, se publicaron diversos estudios en células y tejidos tumorales que demuestran que los LT favorecen la proliferación celular. Sin embargo, esta interesante propiedad no ha sido aún estudiada en la proliferación que ocurre en el hígado posterior a una resección hepática. En un trabajo previo a nuestros estudios, se analizó la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico durante la regeneración hepática posterior a una hepatectomía parcial (HP) y se reportó un notable aumento en la expresión de genes que promueven la síntesis de LT, incluido el de la 5-LOX. Sin embargo, no se indagó sobre el papel de dicha inducción en la regeneración hepática. En base a lo publicado hasta la actualidad y a nuestras evidencias experimentales, construimos una hipótesis de trabajo donde postulamos que los LT producidos en el hígado intervienen como mediadores de la proliferación, actuando como moléculas señalizadoras que favorecen el proceso proliferativo posterior a una HP. El objetivo general de la presente tesis es estudiar el rol de los LT como mediadores de la proliferación hepática en el modelo de regeneración del hígado posterior a una HP de dos tercios en ratas. De esta manera, estudiamos la síntesis de LT durante la regeneración del hígado posterior a una HP y el efecto de bloquear la producción de los mismos. Para ello, ratas Wistar macho adultas fueron sometidas a una HP de dos tercios y se trataron con zileutón (Zi), un inhibidor específico de la 5-LOX. Nuestro primer hallazgo fue un incremento significativo del leucotrieno B4 (LTB4) intrahepático durante la primera hora luego de la HP, junto con un aumento en la expresión de la 5-LOX. Ambos incrementos ocurrieron a tiempos tempranos post-HP y no se observaron en momentos posteriores; es más, a estos tiempos se observó una disminución en la expresión de la 5-LOX y en los niveles hepáticos del LTB4. Interesantemente, la inducción de la 5-LOX durante los tiempos iniciales de la regeneración hepática parece ser un evento general en roedores, ya que también observamos un aumento en los niveles del ARN mensajero (ARNm) y de la proteína de la 5-LOX en ratones. El patrón de expresión de la 5-LOX fue el opuesto al observado para la ciclooxigenasa-2 (COX-2), enzima que, utilizando AA, participa en la síntesis de otros eicosanoides cuyos productos son necesarios para la regeneración a tiempos posteriores de la HP. El Zi redujo los niveles hepáticos del LTB4 en el momento de la hepatectomía y también inhibió el aumento del LTB4 hepático 1 h post-HP. El estudio de la proliferación de los hepatocitos a las 24 h post-HP (momento en donde ocurre un primer pico de síntesis de ADN en ratas) mostró un retraso en la proliferación hepática determinado por la disminución de la expresión del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y de la proteína ciclina D1 y un aumento del inhibidor del ciclo celular p21. La disminución del LTB4 hepático producida por el tratamiento con Zi se asoció con una reducción tanto en el ARNm de la interleuquina-6 (IL-6) como en la actividad del factor nuclear kB (NF-kB) a la hora post-HP, fenómenos que ocurren principalmente en células de Kupffer. Asimismo, observamos una disminución en los marcadores de las distintas poblaciones de células de Kupffer/ macrófagos y un aumento de la apoptosis de las células no parenquimatosas (NPC) a las 24 h post-HP en los animales tratados con el fármaco. A tiempos más tempranos (5 h post HP) observamos un aumento en los niveles de marcadores que indican la presencia de neutrófilos en el hígado de ratas control y una disminución de dichos marcadores cuando los animales fueron tratados con Zi. En conclusión, el presente trabajo proporciona evidencias de que la activación de la 5-LOX y su producto, el LTB4, están involucrados en los eventos iniciales de la regeneración hepática post-HP y la inhibición farmacológica de esta enzima puede retrasar el fenómeno. Los resultados también demuestran que el LTB4 está implicado en la señalización entre los diferentes tipos de leucocitos que son reclutados al hígado luego de una HP, proceso necesario para que ocurra una correcta regeneración hepática.Ítem Embargo Transferencia génica de aquaporina-8 a mitocondrias: modulación del metabolismo del amoníaco a urea(2021) Capiglioni, Alejo M.; Marinelli, Raúl A.; Alvarez, María de LujánLas Aquaporinas (AQPs) conforman una familia de canales de membrana que facilitan el transporte osmótico de agua y en algunos casos, la difusión de moléculas pequeñas no cargadas. Desde su descubrimiento en 1992 se fue ampliando el conocimiento sobre la estructura, localización celular/subcelular y función de estas proteínas. Actualmente se conocen trece miembros de esta familia en mamíferos, donde cada tejido tiene un patrón de expresión característico. La aquaporina 8 (AQP8), como miembro de esta familia, presenta permeabilidad al agua y también a moléculas como el amoníaco y el peróxido de hidrógeno. Su forma no glicosilada de 28 kDa se expresa en membrana mitocondrial interna de hepatocitos donde se ha demostrado participa en procesos metabólicos y en señalización. La presencia de la AQP8 en la membrana mitocondrial facilita el ingreso difusivo del amoníaco para su metabolización a urea. El metabolismo del nitrógeno es esencial en el organismo, formando parte de moléculas con relevancia estructural y funcional. El amoníaco proveniente del catabolismo de proteínas y ácidos nucleicos debe ser eliminado rápidamente para evitar su acumulación plasmática y el desarrollo de cuadros fisiopatológicos. El hígado se encarga de la detoxificación del amoníaco principalmente mediante su transformación a urea en los hepatocitos. Se ha demostrado que la expresión defectiva de la AQP8 mitocondrial (mtAQP8) tiene impacto negativo en la capacidad de los hepatocitos para metabolizar el amoníaco a urea. También se ha demostrado que en situaciones fisiopatológicas complejas en las que se observa el desarrollo de cuadros de hiperamonemia, la expresión de la mtAQP8 se encuentra disminuida. A partir de esto, decidimos evaluar si la transferencia génica de AQP8 a mitocondrias del hepatocito tenía la capacidad de estimular el metabolismo del amoníaco a urea, tanto en situaciones normales como de ureagénesis defectiva. Lo primero que se analizó fue la exposición de hepatocitos aislados al adenovector AdhAQP8, que codifica para la AQP8 de origen humano (hAQP8). AdhAQP8 permitió la correcta expresión de hAQP8 en membrana interna de las mitocondrias, sin modificar la viabilidad celular ni la expresión de otras proteínas mitocondriales. La expresión mitocondrial de la hAQP8 indujo un aumento significativo en la conversión del amoníaco a urea sin modificar la ureagénesis a partir de aminoácidos que funcionan como fuentes intramitocondriales de amoníaco. Estudios con mitocondrias aisladas de hepatocitos transducidos con hAQP8 demostraron directamente que la expresión mitocondrial de hAQP8 favorece una mayor detoxificación del amoníaco. A continuación, desarrollamos un modelo de hepatocitos con metabolización deficiente del amoníaco a urea utilizando el hepatotóxico tioacetamida (TAA). Los estudios dosis- respuesta nos permitieron encontrar condiciones experimentales en las que la ureagénesis a partir del amoníaco se vio afectada pero no así la viabilidad celular. El avance de los estudios nos permitió demostrar que la conversión del amoníaco a urea en hepatocitos, reducida por TAA, pudo ser normalizada por la transferencia génica mitocondrial de hAQP8. Por último, realizamos ensayos de puesta a punto de transferencia génica in vivo de hAQP8, administrando el adenovector AdhAQP8 vía transduodenal retrobiliar. Observamos que AdhAQP8 indujo la expresión mitocondrial de hAQP8, la cual fue acompañada de un aumento en los niveles hepáticos de urea. Aunque no pudimos profundizar los estudios, los mismos sugieren que la expresión mitocondrial hepática de hAQP8 estimularía la ureagénesis tanto en hepatocitos aislados como in vivo. En conclusión, nuestros resultados refuerzan el rol de la mtAQP8 como una proteína necesaria para facilitar el ingreso mitocondrial del amoníaco para su metabolización en el ciclo de la urea; y permiten considerar el potencial terapéutico de la utilización de la transferencia génica de AQP8 para mitigar cuadros de hiperamonemia.