Estudio de la función del gen PN TGS1 en el desarrollo reproductivo vegetal

Paspalum notatum es una gramínea modelo utilizada para estudiar la apomixis, un tipo de reproducción asexual por semillas que permite la formación de progenies clonales idénticas a la planta madre. En trabajos anteriores nuestro grupo determinó que el gen PN_TGS1-like (similar a TRIMETILGUANOSINA SINTASA 1) se expresa en óvulos de plantas sexuales de P. notatum, pero está reprimido en plantas apomícticas. TGS1 codifica una metiltransferasa con rol dual, que promueve la biogénesis de sn(o) ARNs trimetilados en el proceso de splicing, y actúa como coactivador transcripcional. La eliminación de su función produce pérdida de la estructura nucleolar y deficiencias en el procesamiento de pre-rARNs y mARNs. Mientras que en levaduras y animales existe una sola copia del gen (TGS1), en plantas se detectan dos (TGS1 y TGS1-like). En P. notatum, la expresión de la copia exclusiva de plantas (TGS1-like) se correlaciona negativamente con la expresividad de la apomixis. Nuestro objetivo fue estudiar el rol de TGS1-like en el desarrollo reproductivo de la especie apomíctica apospórica P. notatum. Para ello, caracterizamos la estructura genómica y las variantes de expresión del gen, usando bases de datos construidas en nuestro laboratorio, y determinamos que existe una sola copia genómica del mismo, que muestra dos variantes de transcriptos florales. Luego, transformamos callos indiferenciados de una planta sexual con una construcción antisentido (pAct1-F1as) que silencia específicamente a TGS1-like. Las plantas antisentido desarrollaron tricomas en la superficie adaxial de la hoja y formación ocasional de óvulos gemelos. El análisis del desarrollo reproductivo en la antesis reveló que las líneas antisentido presentaban un 12,93-15,79% de los óvulos con sacos embrionarios de tipo apospórico (similares a SEA), y un 8,42-9,52% con una combinación de sacos meióticos y apospóricos. Además, en premeiosis/meiosis, el 32,5% de los óvulos mostraban células similares a iniciales de la aposporía (IAs) rodeando a la célula madre de la megáspora (CMM) o a las díadas meióticas derivadas de CMM. Estas IAs no iniciaban divisiones meióticas, por lo que podría inferirse que los sacos embrionarios supernumerarios detectados en antesis eran de tipo “no reducidos”. Las líneas antisentido producían una cantidad de polen y un conjunto de semillas viables equivalentes a las controles después de la autopolinización. Los análisis de citometría de flujo en cariopses derivados de líneas antisentido revelaron que todas las semillas viables se habían originado por sexualidad. Además, al comparar las líneas antisentido con los controles, detectamos una reducción de un 25,55% en el porcentaje de germinación. Para analizar si TGS1-like afectaba al proceso de clivado y empalme, comenzamos por seleccionar en nuestras bases transcriptómicas (454/Roche FLX +) los 316 transcriptos con mayor expresión diferencial en flores de plantas apomícticas y sexuales (nótese que ambos tipos de plantas expresan diferencialmente al gen TGS1-like en flores) (FDR < 6,74E-10). Luego analizamos cuáles de estos transcriptos diferenciales podrían corresponder a posibles variantes de splicing. Así, detectamos que una variante de splicing de CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1B-21 (CHLORO, isotig 23387) presentaba menor representación en el transcriptoma de plantas apomícticas con respecto a sexuales. La expresión diferencial de dicha variante de splicing fue validada en varios individuos con diferente modo de reproducción mediante qRT-PCR. Además, un análisis del procesamiento de CHLORO en las líneas antisentido tgs1-like confirmó que la expresión de esa misma variante de splicing está disminuida respecto a los controles, lo que confirma que la actividad de TGS1-like es necesaria para su formación. A partir de estos resultados, concluimos que CHLORO es uno de los blancos de TGS1-like. Además, identificamos un grupo numeroso de transcriptos relacionados con el splicing, que están diferencialmente representados en órganos reproductivos de plantas de P. notatum, y determinamos que conforman una red de interacciones junto con TGS1-like. En conjunto, nuestros resultados sugieren que, durante el proceso de reproducción sexual, TGS1-like se expresa en la nucela del óvulo e inhibe la formación de sacos embrionarios múltiples. La inhabilitación de la función TGS1-like provoca la aparición de células similares a IAs en la nucela, y luego sacos embrionarios supernumerarios, con morfología similar a los sacos embrionarios apospóricos, y posiblemente no reducidos. Sin embargo, la desregulación de PN_TGS1 no es suficiente para inducir la formación de progenie materna, ya que estos gametofitos extra no son capaces de llevar a cabo la partenogénesis y/o desarrollar endospermo viable. Además, la desregulación de PN_TGS1-like está asociada a defectos en la germinación de las semillas, aún de aquellas formadas por sexualidad, por lo que no descartamos un rol durante la embriogénesis y/o el desarrollo del endospermo. La regulación ejercida por PN_TGS1-like en la nucela del óvulo está enmarcada (al menos parcialmente) en un control del proceso de clivado y empalme, siendo la proteína cloroplástica de codificación nuclear CHLORO uno de sus genes blanco. Por otra parte, varios otros genes relacionados con la actividad de la maquinaria de splicing muestran una actividad diferencial durante la apomixis, y podrían integrar una red de interacciones funcionales junto con TGS1-like. En trabajos futuros deberán identificarse las relaciones funcionales entre los miembros de dicha malla, así como también la correspondencia entre el control ejercido por TGS1 sobre el cloroplasto y el splicing.