Examinando por Autor "Soncini, Fernando C."
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Ítem Acceso Abierto Control de la homeostasis de zinc y su rol en la virulencia de Salmonella(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-28) Scampoli, Nadia Lorena; Soncini, Fernando C.El cobre y el zinc son iones metálicos esenciales, pero tóxicos en exceso. Las bacterias han desarrollado estrategias tanto específicas para dichos iones como no específicas, de manera de controlar la concentración intracelular de ambos metales, asegurando un suministro adecuado y al mismo tiempo evitando su toxicidad. En el primer Capítulo de esta Tesis, comparamos los perfiles transcripcionales de Salmonella Typhimurium luego de exponer a la bacteria a un exceso de cobre y zinc por un periodo de tiempo en un medio rico y en un medio mínimo. Además de las vías regulatorias específicas para dichos metales, observamos que muchas vías de respuesta a estrés global también se activan ante un exceso de estos metales. En el segundo Capítulo, nos enfocamos en la respuesta de genes del regulón Zur de Salmonella frente a un exceso de cobre y zinc. Reconocimos un patrón de expresión característico de estos genes y, de esta manera, identificamos nuevos genes pertenecientes al regulón. Los genes identificados en esta Tesis codifican para dos proteínas ribosomales que, a diferencia de sus parálogos, no unen iones zinc (RpmE2 y RpmJ2); dos inhibidores de lisozimas tipo G (STM14_1454 y STM14_3193); y por último, un gen que codifica a un ARN pequeño cuyo blanco no ha sido identificado aún (isrD). Verificamos los perfiles trancripcionales de estos genes por RT-PCR semicuantitativa y/o por ensayos de actividad β-galactosidasa, y confirmamos que el represor Zur es el responsable de su regulación transcripcional, y que interacciona directamente con los promotores de estos genes. Observamos que la inducción de los genes del regulón Zur responde a distintas concentraciones de zinc en el medio, aconteciendo de manera jerárquica, permitiéndonos proponer un modelo de expresión secuencial donde los genes se transcriben de acuerdo a la severidad de la escasez de zinc a la que la bacteria se enfrenta. Por otro lado, se determinó que los genes STM14_1454 y STM14_3193 no están involucrados en el crecimiento de Salmonella en medios con baja concentración de zinc, pero están implicados en la sobrevida dentro de células fagocíticas. Por último, en el tercer Capítulo detectamos genes relacionados con la homeostasis de hierro que se inducen ante el agregado de cobre en el medio. Estos hallazgos nos permitieron establecer la existencia de una nueva vía de detoxificación del cobre donde la enterobactina y el transportador TolC están involucrados.Ítem Acceso Abierto Evolution of Copper Homeostasis and Virulence in Salmonella(Frontiers Media, 2022-03-16) Méndez, Andrea A. E.; Mendoza, Julián I.; Echarren, María Laura; Terán, Ignacio; Checa, Susana Karina; Soncini, Fernando C.Ítem Acceso Abierto Homeostasis de cobre en Salmonella enterica : análisis transcripcional y funcional del sistema Scs y otros sistemas involucrados(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2017-03-29) López, María Carolina; Soncini, Fernando C.S. enterica subespecie enterica serovar Typhimurium es uno de los serovares no tifoideos más comúnmente aislados en el mundo y tiene la capacidad de persistir y proliferar en el medio ambiente desarrollando un estilo de vida cíclico hospedadorambiente externo-hospedador. En estos hábitats S. Typhimurium encuentra metales de transición esenciales y/o tóxicos que pueden afectar su sobrevida cuando su concentración supera un umbral determinado. Este patógeno ha desarrollado sistemas que le permiten monitorear iones de cobre y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de este metal para mantener su homeostasis y prevenir su toxicidad. El regulador transcripcional CueR detecta de manera específica los iones de Cu(I) en el citoplasma e induce la transcripción de copA, cuiD y cueP. Los productos de estos genes participan en forma directa y específica en la resistencia al metal. Salmonella dispone además de sistemas no específicos de respuesta a estrés celular que son importantes moduladores de las respuesta global a metales. En este trabajo de Tesis vinculamos al sistema de dos componentes de respuesta a estrés de envoltura CpxR/CpxA con la homeostasis de cobre en Salmonella. En el Capítulo I, dilucidamos el rol fisiológico de la regulación coordinada de cueP por parte de CueR y de CpxR/CpxA. Demostramos que la función de CueP frente al estrés por cobre en anaerobiosis depende de esta co-regulación, y que este control transcripcional estricto es necesario para permitir la expresión de CueP únicamente en las condiciones ambientales dónde es requerida. Asimismo estudiamos en detalles los aspectos mecanísticos de esta regulación, demostrando que son requeridos tanto la forma metalada de CueR (CueRCu), como CpxR fosforilado (CpxR~P) para promover la formación de complejos activos y productivos para el inicio de la transcripción de cueP. En el Capítulo II identificamos a los genes del locus scs, específicos de este patógeno, como nuevos miembros del regulón Cpx, profundizando en el vínculo entre la respuesta Cpx y el equilibrio de los niveles de cobre que generan estrés en la envoltura de Salmonella. Demostramos que la inducción por cobre de estos genes depende de la activación por parte del sistema Cpx. La sobrevida y persistencia de Salmonella también puede ser afectada por un desbalance entre la producción de especies reactivas y la producción y/o acción de los antioxidantes. En este trabajo avanzamos en la caracterización de sistemas extracitoplasmáticos que participan en la protección contra el daño oxidativo en la envoltura bacteriana.Ítem Acceso Abierto Reconocimiento selectivo sensor/operador en reguladores de respuesta a metales monovalentes en Salmonella enterica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-03-27) Humbert, María Victoria; Soncini, Fernando C.Dos reguladores transcripcionales parálogos de la familia MerR, CueR y GolS, son responsables de la detección y la resistencia a iones de metales monovalentes en Salmonella enterica. A pesar de que presentan un grado de similitud alto en su secuencia proteica y en la secuencia nucleotídica de sus operadores blanco, estas proteínas difieren en la naturaleza de la señal que reconocen así como en el conjunto de genes cuya transcripción regulan. Recientemente, en el laboratorio donde se desarrolló esta Tesis se demostró que el reconocimiento selectivo de secuencias promotoras depende de la presencia de bases específicas localizadas en las posiciones 3´ y 3 de los operadores reconocidos por estos reguladores. En el primer Capítulo de la presente Tesis demostramos que el residuo de metionina en la posición 16 de GolS, absolutamente conservado entre proteínas homólogas a este regulador pero ausente en todos los xenólogos del tipo CueR, es clave para el reconocimiento selectivo de secuencias promotoras que presentan la marca distintiva de todos los operadores regulados por GolS, en tanto que el residuo en la posición 19 auxilia en la interacción específica sensor/operador; y que el reemplazo de estos residuos por los conservados en el regulador parálogo cambia el conjunto de genes reconocidos por estos factores transcripcionales. A su vez, demostramos que existe una actividad regulatoria diferencial entre CueR de Salmonella, CueR STM, y su ortólogo de E. coli, CueREC, probablemente debido a diferencias sutiles en el dominio N-terminal de unión al ADN. Estos resultados indican que la co-evolución de un regulador y sus operadores blanco dentro de la célula bacteriana provee de las condiciones necesarias para evitar el reconocimiento cruzado y garantizar la respuesta adecuada al daño provocado por un estresante dado, en este caso un ión metálico. Finalmente, iniciamos la caracterización de otro regulador transcripcional MerR, específico de Salmonella y homólogo a MlrA, implicado en la regulación de la motilidad en y la formación de biopelículas. Los resultados que se describen en el segundo Capítulo de esta Tesis demuestran que altos niveles de STM1266 disminuyen la motilidad, incrementan la producción y secreción de celulosa, confieren mayor resistencia a estreptomicina y estimulan la formación de biopelículas, posiblemente debido a la participación de este regulador en la modulación transcripcional de csgD.Ítem Embargo Reguladores transcripcionales específicos de Salmonella involucrados en formación de biopelículas y en virulencia(2022) Echarren, María Laura; Soncini, Fernando C.Salmonella enterica es el agente causal de enfermedades como la gastroenteritis y la fiebre entérica, constituyendo un problema grave para la salud pública a nivel mundial. Un aspecto esencial en el ciclo de vida de Salmonella que contribuye a su interacción con el hospedador y su persistencia en el ambiente es su capacidad de formar biopelículas. Las biopelículas son comunidades de bacterias inmersas en una matriz extracelular autoproducida que les permite adherirse entre sí y a diversas superficies bióticas y abióticas. En Salmonella, la matriz extracelular está compuesta principalmente de una fimbria agregativa de tipo curli y del expopolisacárido celulosa. La síntesis de estos componentes y la transición al estilo de vida comunitario están controladas principalmente a nivel transcripcional por el regulador maestro, CsgD. A su vez, la expresión de este activador transcripcional está controlada por varios factores de transcripción que integran diferentes señales ambientales. El principal activador de la expresión de csgD en S. enterica y Escherichia coli es MlrA, un factor de transcripción de la familia MerR. El objetivo principal de esta Tesis fue el de caracterizar a nivel funcional al regulador transcripcional de tipo MerR específico de Salmonella enterica, MlrB, homólogo MlrA, con especial énfasis en dilucidar su rol en la formación de biopelículas y en la adaptación a un estilo de vida intracelular. En el primer capítulo, describimos a MlrB, un regulador ubicado en la Isla de Patogenicidad 2 de Salmonella (SPI-2) que codifica para diversos factores de virulencia necesarios para la supervivencia intracelular de este patógeno. A su vez, MlrB presenta un 70 % de identidad con MlrA, principalmente en la región involucrada en el reconocimiento al ADN. Mediante ensayos fenotípicos y de regulación transcripcional, determinamos que, en las condiciones reportadas como óptimas para la formación de biopelículas, MlrA ejerce un papel predominante en la en la inducción de la expresión de CsgD y en la síntesis de componentes de matriz extracelular y formación de biopelículas, mientras que MlrB no afecta este proceso. Los resultados del primer capítulo pusieron en evidencia la posibilidad de que MlrA y MlrB reconozcan señales inductoras distintas y modulen la formación de biopelículas en condiciones ambientales diferentes, debido a que estas proteínas presentan una menor identidad en el dominio C-terminal responsable de la unión al inductor en los miembros de la familia MerR. En la segunda parte de este trabajo, dilucidamos que MlrB incrementa su expresión en las condiciones que inducen a los genes que codifican para el Sistema de Secreción tipo III (SST3) ubicados en la SPI-2 de Salmonella, mientras que MlrA sigue el patrón opuesto. Mediante ensayos de actividad transcripcional, demostramos que la activación de MlrB no depende del regulador maestro de los genes del SST3, SsrB. Tampoco evidenciamos que MlrB actúe corriente arriba de SsrB, modulando su expresión. Por otro lado, comprobamos que la expresión de MlrB requiere de la activación de PhoP y PmrA, dos reguladores respuesta de sistemas reguladores clave para la supervivencia intracelular y para el control de las modificaciones en el lipopolisacárido, respectivamente. A su vez la expresión de MlrB depende de H-NS, un represor de genes adquiridos por transferencia horizontal. Los resultados en el segundo capítulo permitieron hipotetizar que MlrB es requerido para la detección de ciertos estímulos encontrados en el estadio intracelular de Salmonella durante el proceso infeccioso. En la última parte de este trabajo, demostramos que MlrB también incrementa su expresión durante el estadio intracelular en macrófagos RAW 264.7 y que es requerido durante la proliferación intracelular de Salmonella. Mediante análisis in silico y pruebas de expresión, identificamos un gen codificado en la SPI-2 de Salmonella, orf319, que se encuentra bajo la regulación transcripcional de MlrB y MlrA. Sin embargo, Orf319, no actúa como un intermediario de MlrB en la proliferación intracelular de Salmonella en macrófagos. Por otro lado, demostramos que MlrB reprime a csgD dentro de macrófagos. El rol intracelular de MlrB podría atribuirse a una disminución de la expresión de celulosa sintasa y producción de celulosa, que actúa como factor de anti-virulencia en este entorno. En conjunto, nuestros hallazgos proporcionan un nuevo vínculo entre la formación de biopelículas y la virulencia de Salmonella.Ítem Acceso Abierto Rol de la proteína periplásmica CueP en la homeostasis de cobre en Salmonella(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-03-11) Pezza, Alejandro; Soncini, Fernando C.Los iones metálicos están involucrados en todas las fases de la vida y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. En particular, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estos iones y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener su homeostasis y prevenir su toxicidad. Salmonella Typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador, dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal. Entre estos, es de destacar a CueR, que ante la presencia de Cu(I) en el citoplasma induce la transcripción de copA, cuiD y cueP. Los productos de estos genes participan en forma directa y específica en la resistencia al metal. Salmonella dispone además de sistemas no específicos de respuesta a estrés celular que son importantes moduladores de las respuesta global a metales. En este trabajo, vinculamos la resistencia al estrés por Cu con el sistema de fosfotransferencia Rcs de respuesta a estrés en la envoltura. Observamos que este sistema se activa en presencia de concentraciones subletales de Cu provocando la síntesis de la cápsula de ácido colánico en la cepa sensible a Cu ΔcuiD. Determinamos que el sistema Rcs confiere resistencia al Cu y que la sobreexpresión de CueP impide la activación de dicho sistema provocada por Cu Por otro lado, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático, que junto con CueR regulan transcripcionalmente la expresión de cueP. Estudiamos los aspectos mecanísticos de esta co-regulación y analizamos su relevancia fisiológica para la sobrevida en condiciones de estrés. Finalmente, identificamos nuevos componentes en el locus cueP; un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 3,5 kDa que denominamos CueQ y que es cotranscripta junto a cueP, y un ARN regulatorio codificado en cis que afecta específicamente la traducción de cueQ dentro del operón.Ítem Acceso Abierto Scs system links copper and redox homeostasis in bacterial pathogens(Elsevier, 2021-02-01) Méndez, Andrea A. E.; Argüello, José M.; Soncini, Fernando C.; Checa, Susana KarinaThe bacterial envelope is an essential compartment involved in metabolism and metabolites transport, virulence, and stress defense. Its roles become more evident when homeostasis is challenged during host–pathogen interactions. In particular, the presence of free radical groups and excess copper in the periplasm causes noxious reactions, such as sulfhydryl group oxidation leading to enzymatic inactivation and protein denaturation. In response to this, canonical and accessory oxidoreductase systems are induced, performing quality control of thiol groups, and therefore contributing to restoring homeostasis and preserving survival under these conditions. Here, we examine recent advances in the characterization of the Dsblike, Salmonella-specific Scs system. This system includes the ScsC/ScsB pair of Cu+-binding proteins with thioloxidoreductase activity, an alternative ScsB-partner, the membrane-linked ScsD, and a likely associated protein, ScsA, with a role in peroxide resistance. We discuss the acquisition of the scsABCD locus and its integration into a global regulatory pathway directing envelope response to Cu stress during the evolution of pathogens that also harbor the canonical Dsb systems. The evidence suggests that the canonical Dsb systems cannot satisfy the extra demands that the host-pathogen interface imposes to preserve functional thiol groups. This resulted in the acquisition of the Scs system by Salmonella. We propose that the ScsABCD complex evolved to connect Cu and redox stress responses in this pathogen as well as in other bacterial pathogens.Ítem Acceso Abierto The protein scaffold calibrates metal specificity and activation in MerR sensors(Wiley Open Access, 2022) Mendoza, Julián I.; Lescano, Julián; Soncini, Fernando C.; Checa, Susana Karina; https://orcid.org/0000-0002-1975-3606; https://orcid.org/0000-0002-8925-7763; https://orcid.org/0000-0003-1629-2848MerR metalloregulators are the central components of many biosensor plat-forms designed to report metal contamination. However, most MerR proteins are non-specific. This makes it difficult to apply these biosensors in the analy-sis of real environmental samples. On-demand implementation of molecular engineering to modify the MerR metal preferences is innovative, although it does not always yield the expected results. As the metal binding loop region (MBL) of these sensors has been proposed to be the major modulator of their specificity, we surgically switched this region for that of well-characterized specific and non-specific homologues. We found that identical modifications in different MerR proteins result in synthetic sensors displaying particular metal-detection patterns that cannot be predicted from the nature of the as-sembled modules. For instance, the MBL from a native Hg(II) sensor provided non-specificity or specificity toward Hg(II) or Cd(II) depending on the MerR scaffold into which it was integrated. These and other evidences reveal that residues outside the MBL are required to modulate ion recognition and trans-duce the input signal to the target promoter. Revealing their identity and their interactions with other residues is a critical step toward the design of more efficient biosensor devices for environmental metal monitoring.