Examinando por Autor "Rasia, Rodolfo M."
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Ítem Acceso Abierto A disordered region retains the full protease inhibitor activity and the capacity to induce CD8+ T cells in vivo of the oral vaccine adjuvant U-Omp19(Elsevier, 2022-09-06) Darriba, María Laura; Pueblas Castro, Celeste; Coria, Lorena M.; Bruno, Laura; Cerutti, María Laura; Otero, Lisandro H.; Chemes, Lucía B.; Rasia, Rodolfo M.; Klinke, Sebastián; Cassataro, Juliana; Pasquevich, Karina A.Ítem Acceso Abierto Análisis y modelado estructural de los dominios catalíticos de DCL1 de Arabidopsis thaliana(2017) Mascali, Florencia Carla; Rasia, Rodolfo M.Ítem Acceso Abierto Bases estructurales del reconocimiento ARN-proteína en el procesamiento de pequeños ARNs en plantas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2014-03-06) Burdisso, Paula; Rasia, Rodolfo M.Los microARNs (miARNs) son moléculas de ARN pequeñas de 21 nucleótidos de longitud que se sintetizan en el núcleo por la ARN polimerasa II. En plantas, están involucrados en la regulación de procesos como el desarrollo, resistencia a estrés y respuestas a hormonas. La biogénesis de miARNs comienza con la transcripción de precursores mas largos, con extensa estructura secundaria de tallo y burbuja dentro de los cuales está contenida la secuencia que corresponde al mensaje de 21 nucleótidos. Estos precursores son procesados por un complejo proteico formado por la ARNasa III DICER-LIKE 1 (DCL1) y las proteínas accesorias HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) y SERRATE (SE). Los precursores de plantas son sumamente heterogéneos. Sin embargo, la maquinaria de procesamiento, es capaz de liberar con precisión el miARN que posteriormente efectuará su acción regulando negativamente ARN mensajeros por complementariedad de bases de Watson y Crick. Durante los últimos años, se han dedicado muchos esfuerzos en descubrir nuevos miARNs, así como también se han logrado numerosos avances respecto a las formas de procesamiento de los precursores de plantas. Sin embargo, el mecanismo por el cual las proteínas de procesamiento llevan a cabo el reconocimiento es hasta el momento poco conocido. En este trabajo realizamos una caracterización biofísica de los dominios de unión a ARN doble hebra. En primer lugar se calculó la estructura en solución del segundo dsRBD de DCL1, a partir de la cual se observó que si bien tiene un plegamiento de dsRBD canónico, presenta diferencias con respecto a dominios homólogos. También se demostró que este dominio es capaz de unir tanto ARNdh como ADN, en contraste con lo que ocurre con la mayoría de los dsRBDs. La caracterización funcional de este dominio demostró que posiblemente actúe como una señal de localización atípica para direccionar a DCL1 al núcleo. Por otro lado, se analizaron los distintos determinantes de unión a sustrato del primer dsRBD de la proteína accesoria HYL1. Para esto, se generaron formas mutantes de la proteína, las cuales mantienen su estructura global, pero afectan las propiedades de unión al sustrato. Sorprendentemente, se demostró que una mutación y hasta una deleción completa en la región que se propone como principal determinante de unión al ARN no causa mayores efectos. Finalmente, se analizó la función de cada mutante in vivo, estableciendo una correlación directa entre la afinidad por los precursores y la actividad de la proteína.Ítem Acceso Abierto Bases moleculares de la biogénesis de microARNs en plantas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-28) Moro, Belén; Palatnik, Javier F.; Rasia, Rodolfo M.Los microARNs (miARN) son ARN pequeños de ~20-22nt, de codificación endógena, que regulan múltiples rutas biológicas a través de la modulación de la expresión génica. En plantas controlan el desarrollo, la señalización hormonal y la respuesta al estrés. En humanos, se considera que el 60% de los genes están regulados por miARNs. Los miARNs reconocen a sus genes blancos por complementariedad de bases, y los guían a su degradación o inactivación traduccional. La especificidad de la interacción miARN-ARN mensajero (ARNm) ha permitido el diseño de miARNs artificiales para silenciar genes de interés. Los miARNs son procesados a partir de largos precursores con extensa estructura secundaria. Estos precursores son cortados por ribonucleasas del tipo III, como DICER LIKE1 (DCL1) en plantas. DCL1 realiza al menos dos cortes sobre el ARN doble hebra (ARNdh) y libera al miARN maduro, de ~21nt, junto a la hebra complementaria del mismo, denominada miARN*. DCL1 es asistida por otras proteínas, como la proteína de unión a ARN doble hebra, HYPONATIC LEAVES1 (HYL1) y la proteína de dedos de zinc SERRATE (SE). Tanto en plantas como en animales el precursor del miARN contiene pistas espaciales que determinan la posición del miARN a lo largo de su secuencia. Mientras que los precursores de animales presentan un tamaño uniforme, los precursores de plantas representan una colección de tamaños y formas variables que pueden ser procesados mediante cuatro mecanismos diferentes. La biogénesis de los miARNs es un proceso clave porque determina la secuencia exacta de nucleótidos del ARN pequeño funcional y por ende los genes regulados por él. Para responder a este interrogante desde un punto de vista genómico hemos desarrollado una técnica denominada SPARE (del inglés, “Specific Parallel Amplification of RNA Ends) que permite analizar los intermediarios de procesamiento de todos los precursores de Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos mediante la técnica de SPARE en conjunto con mutagénesis dirigida de los precursores de miR171, miR156/miR157 y mIR319 nos ha permitido caracterizar mecanismos de procesamiento exclusivos de plantas que implican el reconocimiento de la porción apical del precursor y la actividad de corte sucesiva de DCL1. A su vez el análisis global del procesamiento de miARN, nos llevó a proponer que la biogénesis de miARNs en plantas depende de la dirección de procesamiento del precursor, el número de cortes necesarios para liberar el miARN maduro y el determinante estructural que es reconocido para ubicar la posición del primer corte.Ítem Acceso Abierto Efficiency and precision of microRNA biogenesis modes in plants(Oxford University Press, 2018-10-05) Moro, Belén; Chorostecki, Uciel Pablo; Arikit, Siwaret; Suárez, Irina Paula; Höbartner, Claudia; Rasia, Rodolfo M.; Meyers, Blake C.; Palatnik, Javier F.Ítem Acceso Abierto Estructura de complejos dsRBD : pri-miRNA a través de restricciones obtenidas por etiquetas paramagnéticas y fluorescentes(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2019-03-11) Mascali, Florencia Carla; Rasia, Rodolfo M.Los miARNs son moléculas de ARN pequeñas que están involucradas en la regulación de procesos fundamentales como el desarrollo, resistencia a estrés y respuestas a hormonas. Su biogénesis comienza con la transcripción de fragmentos más largos que son procesados en forma precisa por la maquinaria de procesamiento. Estos precursores son sumamente heterogéneos en plantas y el modo de reconocimiento de la maquinaria de procesamiento aún no ha sido resuelto. Por ello resulta interesante estudiar, desde una perspectiva estructural, la participación de las proteínas que forman parte del complejo. En particular, este trabajo de Tesis se centra en la proteína de procesamiento de miARN HYL1 de Arabidopsis thaliana. HYL1 posee dos dominios de unión a ARN doble hebra (dsRBD) unidos por un linker. A partir de una búsqueda bioinformática se analizó la conservación de tamaño y de secuencia del linker en proteínas que contienen dobles dsRBDs en distintas especies. Se pudo concluir que el largo del linker está muy conservado en especies plantas, en contraste con lo que se observa en especies del reino animal. Para comprender el rol de HYL1 dentro del complejo se planteó estudiar la distribución espacial que podrían presentar sus dominios de unión a ARN cuando están libres y/o unidos a ARN. En forma experimental se llevaron a cabo estudios que dan medidas de distancia en escala de nanómetros, en el rango de distancias que separan los dominios. Estas medidas se utilizaron luego en la selección de estructuras probables dentro de un conjunto de estructuras posibles generadas in silico. Las medidas fueron obtenidas a partir de técnicas de resonancia magnética sobre muestras que contienen la etiqueta LBT (Lanthanide Binding Tag). Se midió Pulsed Electron DOuble Resonance (PELDOR) entre las sondas para estimar la distancia entre dominios, tanto en forma libre como unida a ARN. La calidad de los datos obtenidos no permitió modelar con precisión la posible distribución de distancias. Por otro lado, se realizaron experimentos de Relajación Paramagnética Electrónica (PRE) midiendo la relajación producida en cada núcleo, la cual está relacionada con la distancia entre dichos núcleos y la sonda. Para la generación de estructuras posibles se trabajó con los programas Modeller y Rosetta, utilizando como molde estructuras cristalográficas disponibles en bases de datos. Con las medidas experimentales se seleccionó una subpoblación de estructuras que ilustra la dinámica entre los dominios cuando están libres utilizando código generado con el lenguaje Python. Las estructuras seleccionadas mostraron una notable cercanía entre sí, en donde los dos dominios se acercan por una de sus caras. Los experimentos sugieren que los dos dominios dsRBDs de HYL1 se mueven libremente, y que la longitud y posición del linker producen una asimetría en la libertad conformacional que estaría dada por restricciones geométricas simples.Ítem Acceso Abierto Estudio bioinformático estructural del reconocimiento de ARN en el procesamiento de miARNs en plantas(2018) Drusin, Salvador Iván; Moreno, Diego M.; Rasia, Rodolfo M.Los microARN (miARN) son moléculas de ARN pequeñas de 21 nucleótidos de longitud que se sintetizan en el núcleo por la ARN polimerasa II. En plantas, están involucrados en la regulación de procesos como el desarrollo, respuestas a estrés y respuestas a hormonas. La biogénesis de miARN comienza con la transcripción de precursores más largos con forma de hebilla dentro de los cuales está contenida su secuencia. Estos precursores son procesados por un complejo proteico formado por la proteína DICER-LIKE 1 (DCL1) junto a otras proteínas accesorias. Los precursores de plantas son sumamente heterogéneos. Sin embargo, la maquinaria de procesamiento, es capaz de liberar con precisión el miARN. En el presente trabajo se realizó un estudio del mecanismo de procesamiento de los precursores de miARN a través de técnicas de simulación computacional. Para ello, se analizaron distintos agentes participantes del proceso: el precursor de miARN, el dominio de unión a ARN de doble hebra de DCL1 (DCL1-1) y los dominios RIIID de DCL1 en los cuales transcurre la reacción de digestión del ARN. La creación de una estructura de un complejo entre DCL1-1 y un ARN de doble hebra (ARNdh) permitió detectar las diferencias entre este dominio y otros similares de diferentes proteínas. El análisis de las simulaciones de dinámica molecular permitió establecer algunos de los elementos principales que le permiten al dominio DCL1-1 identificar al precursor de miARN. Principalmente, se halló que el residuo Arg8 es un residuo importante en este proceso ya que puede reconocer pares de bases no canónicos en el ARNdh objetivo y anclar el dominio en una posición específica del mismo. Estos hallazgos fueron validados experimentalmente. El modelado de diferentes pares de base en la secuencia de dos precursores de miARN permitió establecer el efecto que las mismas tienen sobre la estructura del ARNdh. Se encontró que los pares de bases no canónicos tienen comportamientos heterogéneos con diferentes grados de estabilidad y de interacción entre las bases. Los resultados hallados permiten explicar las diferencias de procesamiento en experimentos de mutación de precursores de miARN. El funcionamiento de los dominios RIIID se estudió a través de la proteína RNasa III bacteriana. Por medio de técnicas de modelado molecular, se construyó el complejo de este dominio con un ARNdh y se realizaron simulaciones de dinámica molecular dirigida a fin de recrear la reacción de hidrólisis sobre su grupo fosfato. Estos experimentos permitieron obtener información sobre el rol que juegan los diferentes elementos que componen el sitio activo: los iones de Mg2+, el nucleófilo, los residuos y las moléculas de solvente cercanas. Se halló que las moléculas de agua vecinas al sitio activo tienen una participación en la reacción al mediar en las transferencias de protones. Por otro lado, se reveló que el nucleófilo no es una molécula de agua, sino un ion hidroxilo. Finalmente, se encontró que los iones catalíticos tienen la capacidad de facilitar la deprotonación de una de las moléculas de agua coordinadas para generar el ion hidroxilo en una posición apropiada para el ataque nucleofílico.Ítem Acceso Abierto Hyponastic leaves 1 is required for proper establishment of auxin gradient in apical hooks(American Society of Plant Biologists, 2021-10-02) Vacs, Paula; Rasia, Rodolfo M.; González Schain, NahuelÍtem Acceso Abierto Identification of key sequence features required for microRNA biogenesis in plants(Nature Research, 2020-10-21) Rojas, Arantxa María Larisa; Drusin, Salvador Iván; Chorostecki, Uciel Pablo; Mateos, Julieta L.; Moro, Belén; Bologna, Nicolás G.; Bresso, Edgardo Gabriel; Schapire, Arnaldo L.; Rasia, Rodolfo M.; Moreno, Diego M.; Palatnik, Javier F.; http://orcid.org/0000-0003-4316-4518; http://orcid.org/0000-0001-5350-514X; http://orcid.org/0000-0003-2229-6853; http://orcid.org/0000-0002-1156-6662; http://orcid.org/0000-0002-2810-3533; http://orcid.org/0000-0002-2161-7910; http://orcid.org/0000-0002-9798-459X; http://orcid.org/0000-0003-3940-067X; http://orcid.org/0000-0001-5493-8537; http://orcid.org/0000-0001-7996-5224MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small RNAs of ∼21 nt that regulate multiple biological pathways in multicellular organisms. They derive from longer transcripts that harbor an imperfect stem-loop structure. In plants, the ribonuclease type III DICER-LIKE1 assisted by accessory proteins cleaves the precursor to release the mature miRNA. Numerous studies highlight the role of the precursor secondary structure during plant miRNA biogenesis; however, little is known about the relevance of the precursor sequence. Here, we analyzed the sequence composition of plant miRNA primary transcripts and found specifically located sequence biases. We show that changes in the identity of specific nucleotides can increase or abolish miRNA biogenesis. Most conspicuously, our analysis revealed that the identity of the nucleotides at unpaired positions of the precursor plays a crucial role during miRNA biogenesis in Arabidopsis.Ítem Acceso Abierto Incidencia de la relación estructura-función del sistema de grupo sanguíneo MN y del receptor cd44 en la adhesión eritrocitaria(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2000-08-28) D'Arrigo, Mabel; Valverde, Juana Rosa; Rasia, Rodolfo M.El objetivo general de la presente tesis es estudiar las alteraciones de propiedades superficiales eritrocitarias y su incidencia en la agregación y la adhesión. Este objetivo fue desarrollado en 4 etapas: 1. Comparar las variaciones de la CESE inducidas por diversos mecanismos, utilizando como herramienta el reparto en sistema acuoso bifásico Dx/PEG. Se trabajó con GR sin tratar y GR con variaciones de la CESE por distintos mecanismos: a)-tratados con distintas enzimas proteolíticas; b)-tripsinados a distintos tiempos; c)-tratados con anticuerpos; d)-sometidos a conservación en condiciones standard de Banco de Sangre y e)- GR de distintas especies. A través del P se pudo poner en evidencia variaciones significativas entre GR tratados y no tratados. De esta manera resulta el P una herramienta útil para el estudio comparativo de las variaciones de la CESE. 2. Estudiar por visualización microscópica directa, la morfología de los agregados de GR. Se estudió la morfología de los agregados de GR sin tratar; tratados (tripsinados a distintos tiempos y glicosilados) y de pacientes diabéticos e hipertensos. Por medio del ASP se mostraron diferencias significativas de la morfología de los agregados de GR sin tratar y tratados. Se observaron diferencias significativas de la morfología de GR normales y de diabéticos e hipertensos. El ASP da una estimación cuantitativa de la morfología de los agregados eritrocitarios y de las desviaciones de la misma. 3. Estudiar la adhesión bajo condiciones estáticas utilizando como modelo el sistema receptor de hialuronato(CD44) –hialuronato observando macroscópicamente, el fenómeno por adhesión (aglutinación) eritrocitaria. Se investigó el receptor de hialuronato en la membrana de GR de adulto, de cordón umbilical y de diabéticos. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la adhesión de GR de adulto y de cordón y también de diabéticos y de adultos normales. Se determinó el receptor de hialuronato(CD44) soluble en suero por inhibición de la adhesión(aglutinación). Se trabajó con suero de dadores normales y de recién nacidos. La sensibilidad de esta técnica no permitió demostrar la presencia de receptores de hialuronato solubles en el suero de neonatos, a diferencia de lo que ocurre en el adulto donde se observó poder inhibitorio. 4. En la última etapa de esta tesis se alcanzó el objetivo propuesto, desarrollar una técnica por análisis de imágenes digitalizadas en cámara de flujo para estimar la energía de adhesión del receptor de hialuronato y su ligando. De acuerdo a las energías calculadas el método es aceptable y puede ser aplicado en otros tipos de interacción celular.Ítem Acceso Abierto Induced folding in RNA recognition by Arabidopsis thaliana DCL1(Oxford University Press, 2015-06-22) Suárez, Irina Paula; Burdisso, Paula; Benoit, Matthieu P. M. H.; Boisbouvier, Jérôme; Rasia, Rodolfo M.Ítem Acceso Abierto Interacción de las proteínas de procesamiento con los precursores de miARN y su mecanismo en plantas(2015-12-14) Suárez, Irina Paula; Rasia, Rodolfo M.DCL1 es la enzima ribonucleasa central en la biogénesis de micro-ARNs en plantas. Su función consiste en realizar dos cortes sucesivos sobre transcriptos primarios para liberar el micro-ARN maduro. El mecanismo a través del cual la enzima reconoce los sitios de corte sobre los precursores resta ser elucidado. La enzima presenta dos dominios de unión a ARN doble hebra en tándem en el extremo carboxilo-terminal, los cuales son esenciales para su funcionamiento in vivo. En este trabajo de tesis nos dedicamos principalmente a la descripción biofísica del primero de los dominios de unión a ARN doble hebra de DCL1 de Arabidopsis thaliana, el cual se encuentra altamente conservado entre las distintas especies de plantas. Demostramos que el dominio libre en solución de encuentra desestructurado tanto en forma aislada como en presencia de regiones vecinas de la proteína. A pesar de estar desestructurado, es capaz de unir ARN sustrato. Mediante el análisis estructural del complejo con el ARN encontramos que el dominio adquiere una conformación plegada al entrar en contacto con el sustrato. La topología de la conformación plegada adquirida, que calculamos en base a datos de RMN, se corresponde con la esperada para un dominio de la familia de los dominios de unión a ARN doble hebra. Una vez definidas las características de este sistema procedimos a realizar, por un lado, una descripción más profunda de la forma libre desestructurada y, por otro, proponer un mecanismo posible para la unión al sustrato y plegamiento de la proteína. De la forma libre podemos decir que globalmente es una especie flexible, aunque no se encuentra completamente desestructurada. A través de distintos observables de RMN logramos determinar que la región correspondiente al extremo carboxilo-terminal presenta una cierta rigidez y explora conformaciones tipo hélice alfa. La presencia de esta estructura preformada podría resultar esencial para la unión al sustrato y el plegamiento. En cuanto al mecanismo de unión y plegamiento pudimos obtener evidencia que sugiere la existencia de un complejo intermediario entre la forma libre desplegada y la forma plegada unida al ARN. En este complejo intermediario la proteína se encuentra en una tercer especie, también mayormente desplegada y unida al sustrato. Finalmente en una tercera etapa del trabajo nos abocamos al estudio desde el punto de vista estructural de precursores completos de micro-ARNs. Buscamos validar los determinantes que permiten reconocer la posición del micro-ARN dentro del precursor por parte del complejo de procesamiento formado por DCL1 y las proteínas accesorias HYL1 y SERRATE. Estudiamos cuatro precursores de diferentes familias por técnicas bioquímicas de sondeo de estructura secundaria y flexibilidad de la cadena. Logramos validar experimentalmente determinantes estructurales propuestos a partir de estructuras calculadas in silico. También encontramos indicios que sugieren que la posición del sitio del primer corte, el cual es fundamental para definir el registro de los cortes sucesivos ejecutados por DCL1, podría estar relacionada con un cambio abrupto desde una región de la hebra con una conformación flexible a una de menor flexibilidad. Esta particularidad podría estar permitiendo una interacción específica con las proteínas que conforman el complejo de procesamiento.Ítem Acceso Abierto Structural determinants of Arabidopsis thaliana Hyponastic Leaves 1 function in vivo(Public Library of Science, 2014-11-19) Burdisso, Paula; Milia, Fernando; Schapire, Arnaldo L.; Bologna, Nicolás G.; Palatnik, Javier F.; Rasia, Rodolfo M.MicroRNAs have turned out to be important regulators of gene expression. These molecules originate from longer transcripts that are processed by ribonuclease III (RNAse III) enzymes. Dicer proteins are essential RNAse III enzymes that are involved in the generation of microRNAs (miRNAs) and other small RNAs. The correct function of Dicer relies on the participation of accessory dsRNA binding proteins, the exact function of which is not well-understood so far. In plants, the double stranded RNA binding protein Hyponastic Leaves 1 (HYL1) helps Dicer Like protein (DCL1) to achieve an efficient and precise excision of the miRNAs from their primary precursors. Here we dissected the regions of HYL1 that are essential for its function in Arabidopsis thaliana plant model. We generated mutant forms of the protein that retain their structure but affect its RNA-binding properties. The mutant versions of HYL1 were studied both in vitro and in vivo, and we were able to identify essential aminoacids/residues for its activity. Remarkably, mutation and even ablation of one of the purportedly main RNA binding determinants does not give rise to any major disturbances in the function of the protein. We studied the function of the mutant forms in vivo, establishing a direct correlation between affinity for the pri-miRNA precursors and protein activity.