Examinando por Autor "Mouguelar, Valeria Soraya"
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Ítem Acceso Abierto Activation of spleen tyrosine kinase (Syk) at fertilization in Rhinella arenarum eggs(University of the Basque Country Press (UBC Press), 2015-07-02) Mouguelar, Valeria Soraya; Coux, GabrielaRecently, we have provided evidence for the involvement of a cytosolic tyrosine–phosphorylatable 70 kDa oocyte protein in Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae) fertilization. The aim of the present work was to characterize its phosphorylation, determine the identity of this protein and establish its biological role during the fertilization process. Tyrosine phosphorylation of the 70 kDa protein was not observed in eggs activated with the calcium ionophore A23187. Pretreatment of oocytes with the tyrosine kinase inhibitor genistein effectively blocked the fertilization-dependent phosphorylation of the 70 kDa protein. In order to identify this protein, we examined the presence in amphibian oocytes of non-receptor 70 kDa tyrosine kinase members of the Syk/Zap70 and Tec families by RT-PCR using degenerate primers. We found that R. arenarum oocytes contain the transcripts coding for Syk and Tec kinases. Western blot analysis confirmed the presence of Syk protein in unfertilized oocytes and eggs. Studies using phospho-Syk specific antibodies showed that fertilization rapidly (less than 10 minutes) induces phosphorylation on Syk tyrosine residues (352 and 525/526) that are necessary for the activation of the enzyme. Finally, specific inhibition of Syk with the R406 compound provoked a diminished fertilization score, thereby confirming a functional role of the Syk protein during R. arenarum fertilization. To our knowledge this is the first time that Syk is described as a player in the signaling cascade activated after fertilization.Ítem Acceso Abierto Beyond the binding site: In vivo Identification of tbx2, smarca5 and wnt5b as molecular targets of CNBP during embryonic development(Public Library of Science, 2013-05-07) Armas, Pablo; Margarit, Ezequiel; Mouguelar, Valeria Soraya; Allende, Miguel L.; Calcaterra, Nora B.CNBP is a nucleic acid chaperone implicated in vertebrate craniofacial development, as well as in myotonic dystrophy type 2 (DM2) and sporadic inclusion body myositis (sIBM) human muscle diseases. CNBP is highly conserved among vertebrates and has been implicated in transcriptional regulation; however, its DNA binding sites and molecular targets remain elusive. The main goal of this work was to identify CNBP DNA binding sites that might reveal target genes involved in vertebrate embryonic development. To accomplish this, we used a recently described yeast one-hybrid assay to identify DNA sequences bound in vivo by CNBP. Bioinformatic analyses revealed that these sequences are G-enriched and show high frequency of putative G-quadruplex DNA secondary structure. Moreover, an in silico approach enabled us to establish the CNBP DNA-binding site and to predict CNBP putative targets based on gene ontology terms and synexpression with CNBP. The direct interaction between CNBP and candidate genes was proved by EMSA and ChIP assays. Besides, the role of CNBP upon the identified genes was validated in loss-of-function experiments in developing zebrafish. We successfully confirmed that CNBP up-regulates tbx2b and smarca5, and down-regulates wnt5b gene expression. The highly stringent strategy used in this work allowed us to identify new CNBP target genes functionally important in different contexts of vertebrate embryonic development. Furthermore, it represents a novel approach toward understanding the biological function and regulatory networks involving CNBP in the biology of vertebrates.Ítem Acceso Abierto Cnbp ameliorates Treacher Collins Syndrome craniofacial anomalies through a pathway that involves redox-responsive genes(Springer Nature, 2016-10-06) Porcel de Peralta, Mauro S.; Mouguelar, Valeria Soraya; Sdrigotti, María Antonella; Ishiy, Felipe A. A.; Fanganiello, Roberto D.; Passos Bueno, Maria R.; Coux, Gabriela; Calcaterra, Nora B.Treacher Collins Syndrome (TCS) is a rare congenital disease (1:50 000 live births) characterized by craniofacial defects, including hypoplasia of facial bones, cleft palate and palpebral fissures. Over 90% of the cases are due to mutations in the TCOF1 gene, which codifies the nucleolar protein Treacle. Here we report a novel TCS-like zebrafish model displaying features that fully recapitulate the spectrum of craniofacial abnormalities observed in patients. As it was reported for a Tcof1+/ − mouse model, Treacle depletion in zebrafish caused reduced rRNA transcription, stabilization of Tp53 and increased cell death in the cephalic region. An increase of ROS along with the overexpression of redox-responsive genes was detected; furthermore, treatment with antioxidants ameliorated the phenotypic defects of craniofacial anomalies in TCS-like larvae. On the other hand, Treacle depletion led to a lowering in the abundance of Cnbp, a protein required for proper craniofacial development. Tcof1 knockdown in transgenic zebrafish overexpressing cnbp resulted in barely affected craniofacial cartilage development, reinforcing the notion that Cnbp has a role in the pathogenesis of TCS. The cnbp overexpression rescued the TCS phenotype in a dose-dependent manner by a ROScytoprotective action that prevented the redox-responsive genes’ upregulation but did not normalize the synthesis of rRNAs. Finally, a positive correlation between the expression of CNBP and TCOF1 in mesenchymal cells from both control and TCS subjects was found. Based on this, we suggest CNBP as an additional target for new alternative therapeutic treatments to reduce craniofacial defects not only in TCS but also in other neurocristopathies.Ítem Acceso Abierto Fecundación en el anfibio Bufo arenarum : rol de las integrinas y proteínas de estrés térmico(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-06-26) Mouguelar, Valeria Soraya; Coux, GabrielaLa reproducción es un proceso biológico que permite la creación de nuevos organismos, siendo una característica común de todas las formas de vida conocidas. Las modalidades básicas de reproducción se agrupan en dos tipos: asexual o vegetativa y sexual o generativa. En todas las especies con reproducción sexual, el proceso de fecundación involucra varias etapas secuenciales en las cuales el espermatozoide debe interactuar con las distintas cubiertas que envuelven al ovocito. Múltiples estudios sugieren que las estrategias y moléculas que participan en el proceso de generación de un nuevo organismo a partir de dos células altamente diferenciadas, presentan un alto grado de conservación entre las distintas especies. Debido a esto, el análisis del proceso de fecundación en especies que se encuentran alejadas evolutivamente del humano puede brindar información no sólo de interés biológico, sino que permitirá, con el tiempo, conocer los detalles de cómo se da este proceso en nuestra especie. El propósito de este Trabajo de Tesis fue contribuir al conocimiento actual de la biología de la reproducción en cuanto a las moléculas involucradas en la interacción que ocurre entre las gametas a nivel de las membranas plasmáticas, utilizando como modelo al anfibio anuro Bufo arenarum. En particular, el objetivo propuesto fue profundizar el estudio de la participación de las integrinas y de las proteínas de estrés térmico pertenecientes a la subfamilia HSPA durante la fecundación. Las integrinas son heterodímeros formados por la unión no covalente entre dos tipos de subunidades: y . El estudio de la participación de estas proteínas durante la fecundación comenzó con el análisis de la expresión de diversas subunidades integrina tanto en ovocitos como en espermatozoides de Bufo arenarum. Experimentos de PCR e inmunodetección pusieron de manifiesto la presencia de las subunidades 5, V y 1 integrina en el ovocito y de la subunidad V integrina en el espermatozoide. Posteriormente, mediante ensayos de fecundación in vitro en presencia de un anticuerpo policlonal diseñado contra el dominio extracelular de la subunidad 1 integrina, se pudo determinar la participación de dicha subunidad en el proceso. Previamente, mediante inmunofluorescencia se había detectado la presencia de la subunidad 1 integrina en la membrana plasmática de cortes citológicos de ovocitos. Sin embargo, los resultados de inhibición de la fecundación debido a la presencia del anticuerpo anti 1 integrina no permitían determinar si dicha subunidad cumplía un rol meramente de adhesión o si también estaba involucrada en la cascada de transducción de señales propia de la fecundación. La comparación del patrón de fosforilación en residuos tirosina de muestras obtenidas a distintos tiempos (minutos) post-fecundación con la de ovocitos tratados con el péptido RGDS (motivo reconocido por numerosas integrinas) permitió inferir que las integrinas median eventos de transducción de señales desde la membrana plasmática del ovocito hacia el interior celular luego de la interacción con el espermatozoide. Sin embargo, no todos los cambios observados luego de la fecundación pudieron ser mimetizados mediante el tratamiento de los ovocitos con el péptido. Este resultado, junto con los obtenidos en experimentos anteriores realizados por nuestro grupo, nos permitió concluir que el péptido RGDS no sería capaz de provocar la activación de los ovocitos de Bufo arenarum. Sin embargo, nos sugirió que algunas señales, aunque no suficientes para activar el metabolismo del ovocito, sí podrían provenir de la señalización mediada por integrinas. El patrón de fosforilacion en restos tirosina común a ambas condiciones (minutos post-fecundación y tratamiento con RGDS) incluyó tres proteínas con pesos moleculares aparentes de 30, 60 y 70 kDa. En el contexto de la bibliografía existente, decidimos analizar la posible identidad de la proteína que presentaba un peso aparente de 70 kDa. Mediante experimentos de PCR realizados sobre ADNc obtenido de ovocitos detectamos la presencia de ARNm que codifican para la proteína Spleen Tyrosine Kinase (SYK), lo que hasta el momento no había sido descripto en ovocitos de vertebrados. Posteriormente, se analizaron muestras obtenidas a distintos tiempos post-fecundación con anticuerpos capaces de reconocer formas fosforiladas en residuos tirosina de la proteína SYK. Se pudo comprobar así, que esta proteína no sólo estaría presente en el ovocito de B. arenarum sino que también se activaría pocos minutos después de la fecundación. En conjunto nuestras evidencias nos permitirían sugerir que la proteína SYK sería parte de la cascada de señalización que se desencadena luego de la interacción que ocurre entre las membranas plasmáticas de las gametas. En cuanto a las proteínas de estrés térmico de la subfamilia HSPA, se determinó la expresión de dichas proteínas en ambas gametas de B. arenarum, hallándose de manera ubicua en el ovocito, y en una ubicación más acotada (acrosoma y pieza media) en el espermatozoide. Mediante ensayos de fecundación in vitro en presencia de un anticuerpo policlonal diseñado contra HSPA se pudo demostrar la participación de esta proteína en la fecundación de B. arenarum. Quizás el resultado más novedoso fue que por primera vez se obtuvieron evidencias acerca de la difusión de la proteína de estrés térmico HSPA desde la membrana plasmática del ovocito y/o alguna de sus cubiertas hacia el medio externo durante la deposición de las gametas. Los resultados presentados en esta Tesis demuestran, a su vez, la unión de esta chaperona liberada con los espermatozoides de B. arenarum. También se determinó que como consecuencia de esta unión se produce un aumento en la viabilidad de los mismos (usando como indicador la integridad de la membrana plasmática). Esta estrategia le permitiría a un mayor número de espermatozoides llegar a encontrarse con los miles de ovocitos que son liberados por la hembra, y de esta manera generar un gran número de embriones. Debido a las condiciones adversas que enfrenta la descendencia de los organismos que presentan fecundación externa, la maximización del número inicial de embriones es central para la supervivencia de la especie, ya que sólo algunos llegan al estadio adulto.