Examinando por Autor "Gramajo, Hugo Cesar"
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Ítem Acceso Abierto 3-methylcrotonyl Coenzyme A (CoA) carboxylase complex is involved in the Xanthomonas citri subsp. citri lifestyle during citrus infection(Public Library of Science (PLOS), 2018-06-07) Tomassetti, Mauro; Garavaglia, Betiana Soledad; Vranych, Cecilia Verónica; Gottig, Natalia; Ottado, Jorgelina; Gramajo, Hugo Cesar; Diacovich, LautaroÍtem Acceso Abierto A conditional mutant of the fatty acid synthase unveils unexpected cross talks in mycobacterial lipid metabolism(Royal Society, 2017-02-22) Cabruja, Matías Ezequiel; Mondino, Sonia Soledad; Tsai, Yi-Ting; Lara, María Julia; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto A novel multidomain acyl-CoA carboxylase in Saccharopolyspora erythraea provides malonyl-CoA for de novo fatty acid biosynthesis(Nature, 2019-04-30) Livieri, Andrea L.; Navone, Laura; Marcellin, Esteban; Gramajo, Hugo Cesar; Rodriguez, EduardoÍtem Acceso Abierto Biochemical characterization of the minimal domains of an iterative eukaryotic polyketide synthase(Wiley, 2018-10-25) Sabatini, Martín; Comba, Santiago; Altabe, Silvia Graciela; Recio Balsells, Alejandro Iván; Labadie, Guillermo Roberto; Takano, Eriko; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaÍtem Acceso Abierto Caracterización de los factores involucrados en la regulación del sistema FAS-I de micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-11-30) Cabruja, Matías Ezequiel; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo CesarLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos (MA) son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los MA involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS-I y FAS-II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS-I y FAS-II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los MA y ácidos grasos (FA) de membrana y lípidos de reserva, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas. Es por esto que se en esta tesis se desarrollaron dos métodos utilizando LC-MS para analizar por un lado el perfil de acil-CoAs, metabolitos intermediarios en la síntesis de lípidos, y por otro un estudio detallado de los lípidos totales en micobacterias. Estas herramientas permitieron al laboratorio analizar en profundidad distintas mutantes en el sistema lipídico en micobacterias. Además, utilizando a M. smegmatis como modelo de estudio, se construyó en el laboratorio una mutante condicional en el gen fas para poder reducir los niveles de esta enzima y estudiar así la interacción entre los dos sistemas FAS. Al observarse que, a pesar de la expresión del sistema FAS-I encontrarse reducida, la producción de MA en la mutante condicional no se encontraba inhibida, decidimos analizar en profundidad el metabolismo lipídico en estas condiciones utilizando las herramientas desarrolladas. De esta manera, junto con un análisis de proteómica de cuantitativa de la mutante condicional, se pudo determinar los efectos de la depleción parcial del sistema FAS-I en el metabolismo lipídico general en M. smegmatis y de esta manera inferir como ambos sistemas FAS se encuentran co-regulados. Estos resultados ayudarán a entender la regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, la cual creemos que proveerá nuevas herramientas para desarrollar nuevos agentes antimicobacterianos.Ítem Acceso Abierto Caracterización molecular de los factores involucrados en la regulación de la biosíntesis de ácidos micólicos en Mycobacterium tuberculosis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-30) Lara, María Julia; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos diferentes, denominadas FAS I y FAS II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS I y FAS II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los ácidos grasos de membrana y de los ácidos micólicos, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas y cuáles serían las señales regulatorias que permiten la correcta interacción entre ambos sistemas metabólicos. En nuestro laboratorio nos propusimos estudiar cómo se regulan a nivel transcripcional los sistemas de síntesis de ácidos grasos y ácido micólicos en micobacterias y caracterizar cuál es la señal a la cual responden. Es así que se ha caracterizado un factor transcripcional de M. tuberculosis denominado FasR (Fatty acid synthase Regulator), al que llamamos FasRMT. Se determinó que esta proteína es un activador transcripcional esencial para la síntesis de ácidos grasos en Mycobacterium smegmatis, y que regula la expresión de los genes del operón fas-acpS mediante su unión a la región promotora de ese operón. De esta manera modula la biosíntesis de novo de ácidos grasos, cuyo destino final son los fosfolípidos de membrana y los triacilglicéridos, como así también los sustratos del sistema FAS II para producir los ácidos micólicos. Además, a partir de una mutante de FasRMT en M. tuberculosis, se ha demostrado que la disminución de FasRMT genera una cepa notablemente afectada en su virulencia. Los resultados de dicha investigación representaron la caracterización de un regulador clave en M. tuberculosis y sentaron las bases para el desarrollo del trabajo de tesis aquí presentado. En este trabajo se presentan los resultados de los experimentos biofísicos y moleculares llevados a cabo para el análisis de la interacción entre FasRMT y las señales regulatorias a las cuales responde por unión específica y directa, los acil-CoA de cadena larga, y la región del ADN que reconoce en el promotor del operón fas-acpS. Además, se validó el modelo de regulación transcripcional propuesto para esta proteína mediante análisis de transcripción in vitro. Se resolvió la estructura tridimensional de una forma truncada del activador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos, FasR33MT, como así también la estructura de FasR33MT en presencia de una de sus moléculas ligando, C20-CoA. A partir de la resolución de estas estructuras, se llevó a cabo el análisis de las mismas para comenzar a comprender los mecanismos moleculares por los cuales la proteína FasRMT modula su actividad. Aún no podemos precisar en detalle cuáles son los cambios que se producen sobre FasRMT y cómo se propagan a partir de la unión al ligando para modular su afinidad por el ADN específico. Sin embargo, se observan características asociadas a la unión del ligando que apoyan un modelo mecanístico de acuerdo al cual, la unión de moléculas de acil-CoA de cadena larga en un túnel hidrofóbico de la proteína desestabilizan la unión de FasRMT al ADN. Considerando que este regulador es esencial para la sobrevida de Mycobacterium, la resolución de la estructura tridimensional de esta proteína permite iniciar la búsqueda y el diseño racional de inhibidores que actúen como nuevos agentes antimicobacterianos.Ítem Embargo Caracterización y análisis de los componentes involucrados en la regulación transcripcional de la síntesis de ácidos micólicos en micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-02-28) Tsai, Yi-Ting; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaLa tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis y se ha convertido en una emergencia sanitaria en los últimos años provocando más de un millón de muertes al año. El éxito de M. tuberculosis como patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad de evadir las respuestas inmunes del húesped y así sobrevivir en el individuo infectado. Para ello, M. tuberculosis ha desarrollado un amplio espectro de lípidos específicos que interactúan activamente con el sistema inmune receptor, entre los cuales podemos mencionar a los ácidos micólicos, uno de los principales lípidos bioactivos presentes en la pared celular de esta bacteria, el cual es esencial para su viabilidad y crucial para su patogenidad. Se sabe que la isoniazida (INH), uno de los fármacos más utilizados para el tratamiento de la TB actúa inhibiendo la biosíntesis de los ácidos micólicos, llevada a cabo por la acción concertada de dos sistemas de sintasa de ácidos grasos presentes en las micobacterias (FAS-I y FAS-II). El sistema FAS-I está involucrado en la biosíntesis de novo de ácidos grasos, liberando acil-CoAs como productos de condensación. Estos compuestos sirven como sustratos para la biosíntesis de los fosfolípidos de la membrana plasmática y los triacilglicéridos de reserva, o pueden ser tomados por el sistema FAS-II para la biosíntesis de ácidos micólicos. Por lo tanto, una correcta interacción entre los dos sistemas FAS sería de vital importancia para las micobacterias a fin de mantener la homeostasis lipídica estrictamente regulada. Los componentes genéticos del sistema FAS-II han sido identificados en M. tuberculosis y se encuentran agrupados en tres unidades transcripcionales principales: fabD-acpM-kasA-kasB (operón fasII), mabA-inhA y hadA-hadB-hadC. Estudios de microarreglos demostraron que el tratamiento de M. tuberculosis con diversos antibióticos que afectan la síntesis de ácidos micólicos, inducen la transcripción de los genes de operón fasII. Esta información condujo a nuestro grupo de investigación a la búsqueda de reguladores transcripcionales que pudieran estar involucrados en la regulación de la homeostasis lipídica de las micobacterias. De esta manera, utilizando el microorganismo modelo M. smegmatis nuestro laboratorio descubrió dos reguladores transcripcionales que controlan el metabolismo lipídico: FasR, un regulador transcripcional que activa el operón que codifica para la enzima FAS-I y MabR, un segundo regulador transcripcional que regula específicamente la expresión del operón fasII. Ambos reguladores mostraron ser esenciales para la viabilidad de las micobacterias, sugiriendo que una regulación estricta del metabolismo lipídico sería fundamental para el desarrollo normal de estas bacterias. Con el fin de profundizar en la caracterización de la red reguladora involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica micobacteriana, en este trabajo de tesis construímos un mutante condicional en el gen mabR y demostramos que la presencia de niveles sub-fisiológicos de este regulador transcripcional conduce a una disminución en la expresión del operón fasII, lo cual nos permitió determinar el rol de MabR como activador transcripcional de dicho operón. Esta disminución en la expresión de MabR se tradujo a su vez en una clara inhibición de la biosíntesis de los ácidos micólicos y una merma en el contenido celular de lípidos complejos que contienen residuos de ácidos micólicos. Además, se observó un aumento notable en el porcentaje de fosfatidil inositol en la membrana plasmática. Todos estos resultados respaldan una activa comunicación entre los dos sistemas FAS. También demostramos que la activación del operón fasII ante el tratamiento con INH es dependiente de MabR y que la afinidad de MabR por la región promotora del operón fasII es modulada in vivo por los acil-CoAs de cadena larga, productos del sistema FAS-I. Por lo tanto, MabR sería un sensor de la composición de acil-CoA en las micobacterias, el cual articula la interacción entre FAS-I y FAS-II para un correcto funcionamiento de la maquinaria lipídica. Finalmente, vimos que ante una deficiencia de los productos de condensación del sistema FAS-I, el sistema FAS-II funciona normalmente utilizando los acil-CoAs provenientes de la degradación de TAG como sustrato alternativo para la biosíntesis de ácidos micólicos. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis, junto con aquellos previamente publicados por nuestro grupo, sugieren que los dos sistemas FAS deben estar estrictamente co-regulados a nivel transcripcional para mantener la homeostasis lipídica en las micobacterias, y que la disrupción o alteración de dicha comunicación conduce a un microorganismo altamente comprometido en su viabilidad.Ítem Acceso Abierto Characterization of key enzymes involved in triacylglycerol biosynthesis in mycobacteria(Scientific Reports, 2021-06-24) Crotta Asis, Agostina; Savoretti, Franco; Cabruja, Matías Ezequiel; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto Complete genome sequence of the Microbacterium foliorum bacteriophage Garey24(American Society for Microbiology, 2024-02-05) Migueletti, Matías R.; García Rey, Julieta; Micheloni, Josefina; Lomanto , Camila; Martelli, Elisa; Sánchez, Gastón; Colombo, Julián M.; Vallecillo, Luciano M.; Lamagni, Francisco; Giusti, Tomás; Acosta, Fabrina; Villagrán, Franco; Gvozdenovich, Martín; Pricco Frakich, Abril; Pianesi, Tulio; Tulin, Gonzalo; Mascali, Florencia Carla; Petitti, Tomás D.; Torres Manno, Mariano A.; Fusari, Corina M.; Buttigliero, Laura; Giordana, María Florencia; Gramajo, Hugo Cesar; Diacovich, Lautaro; Espariz, Martín; Mussi, María Alejandra; http://orcid.org/0000-0002-3339-0100; http://orcid.org/0000-0002-4090-515X; http://orcid.org/0000-0002-4168-3624In this work, we report the discovery and characterization of Garey24, a bacteriophage that forms medium-size plaques with halo rings isolated from a soil sample in Funes, Argentina. Its 41,522 bp circularly permuted genome contains 63 putative protein-coding genes. Based on gene content similarity, Garey24 was assigned to subcluster EA1.Ítem Acceso Abierto Engineering a Streptomyces coelicolor biosynthesis pathway into Escherichia coli for high yield triglyceride production(BMC, 2014-12) Comba, Santiago; Sabatini, Martín; Menendez Bravo, Simón M.; Arabolaza, Ana Lorena; Gramajo, Hugo CesarBackground: Microbial lipid production represents a potential alternative feedstock for the biofuel and oleochemical industries. Since Escherichia coli exhibits many genetic, technical, and biotechnological advantages over native oleaginous bacteria, we aimed to construct a metabolically engineered E. coli strain capable of accumulating high levels of triacylglycerol (TAG) and evaluate its neutral lipid productivity during high cell density fed-batch fermentations. Results: The Streptomyces coelicolor TAG biosynthesis pathway, defined by the acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT) Sco0958 and the phosphatidic acid phosphatase (PAP) Lppβ, was successfully reconstructed in an E. coli diacylglycerol kinase (dgkA) mutant strain. TAG production in this genetic background was optimized by increasing the levels of the TAG precursors, diacylglycerol and long-chain acyl-CoAs. For this we carried out a series of stepwise optimizations of the chassis by 1) fine-tuning the expression of the heterologous SCO0958 and lppβ genes, 2) overexpression of the S. coelicolor acetyl-CoA carboxylase complex, and 3) mutation of fadE, the gene encoding for the acyl-CoA dehydrogenase that catalyzes the first step of the β-oxidation cycle in E. coli. The best producing strain, MPS13/pET28-0958 ACC/pBAD-LPPβ rendered a cellular content of 4.85% cell dry weight (CDW) TAG in batch cultivation. Process optimization of fed-batch fermentation in a 1-L stirred-tank bioreactor resulted in cultures with an OD600nm of 80 and a product titer of 722.1 mg TAG L-1 at the end of the process. Conclusions: This study represents the highest reported fed-batch productivity of TAG reached by a model non-oleaginous bacterium. The organism used as a platform was an E. coli BL21 derivative strain containing a deletion in the dgkA gene and containing the TAG biosynthesis genes from S. coelicolor. The genetic studies carried out with this strain indicate that diacylglycerol (DAG) availability appears to be one of the main limiting factors to achieve higher yields of the storage compound. Therefore, in order to develop a competitive process for neutral lipid production in E. coli, it is still necessary to better understand the native regulation of the carbon flow metabolism of this organism, and in particular, to improve the levels of DAG biosynthesis.Ítem Acceso Abierto Escherichia coli coculture for de novo production of esters derived of methyl-branched alcohols and multi-methyl branched fatty acids(BioMed Central Ltd, 2022-01-15) Bracalente, Fernando; Sabatini, Martín; Arabolaza, Ana Lorena; Gramajo, Hugo CesarÍtem Acceso Abierto Estudio de la interacción del metabolismo del nitrógeno y del carbono en micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-07-04) Bulssico, Julián Agustín; Gramajo, Hugo Cesar; Cabruja, Matías EzequielEn el presente trabajo de tesina, se llevó a cabo la caracterización del regulador transcripcional putativo NlpR, codificado por el gen MSMEG_0432 de Mycobacterium smegmatis. Con este objetivo, se construyó una cepa mutante (M. smegmatis ΔnlpR) que posee una deleción de 1023 pares de bases en MSMEG_0432 mediante intercambio alélico por recombinación homóloga. El análisis del fenotipo de crecimiento de la cepa M. smegmatis ΔnlpR, en comparación con la cepa salvaje, demostró que la misma es incapaz de crecer utilizando nitrato de potasio o nitrito de sodio como fuentes exclusivas de nitrógeno; mientras que, al utilizar cloruro de amonio el crecimiento de la cepa mutante y salvaje fueron similares. A su vez, la complementación de la mutación con un alelo salvaje de MSMEG_0432 a través de un vector integrativo y bajo un promotor inducible por el agregado de anhidrotetraciclina (ATc) permitió restaurar el crecimiento con nitrato de potasio y nitrito de sodio como única fuente de nitrógeno a niveles comparables con la cepa salvaje. Estudios previos, realizados en los genes ortólogos a MSMEG_0432 en Rhodococcus jostii RHA1, sugirieron que dicho gen actuaría como un regulador transcripcional pleiotrópico, mediando la interacción del metabolismo de nitrógeno y carbono en respuesta a la carencia de fuentes de nitrógeno en el medio externo. Sin embargo, en el presente estudio no pudo comprobarse la influencia de MSMEG_0432 en genes relacionados al metabolismo del carbono. Las cromatografías en capa delgada (TLC) no mostraron variaciones tanto en la acumulación como en la síntesis de novo de TAG en las cepas mutante y salvaje. Asimismo, la sobreexpresión de dicho gen en una cepa salvaje no mostró un cambio significativo en la síntesis de lípidos neutros.Ítem Acceso Abierto Expression and purification of untagged GlnK proteins from actinobacteria(EXCLI, 2017-06-27) Gerhardt, Edileusa C. M.; Moure, Vivian R.; Souza, Andrey W.; Pedrosa, Fabio O.; Souza, Emanuel M.; Diacovich, Lautaro; Gramajo, Hugo Cesar; Huergo, Luciano F.The PII protein family constitutes one of the most conserved and well distributed family of signal transduction proteins in nature. These proteins play key roles in nitrogen and carbon metabolism. PII function has been well documented in Gram-negative bacteria. However, there are very few reports describing the in vitro properties and function of PII derived from Gram-positive bacteria. Here we present the heterologous expression and efficient purification protocols for untagged PII from three Actinobacteria of medical and biotechnological interest namely: Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus jostii and Streptomyces coelicolor. Circular dichroism and gel filtration analysis supported that the purified proteins are correctly folded. The purification protocol described here will facilitate biochemical studies and help to uncover the biochemical functions of PII proteins in Actinobacteria.Ítem Acceso Abierto FasR regulates fatty acid biosynthesis and is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis(Frontiers Media, 2020-10-27) Mondino, Sonia Soledad; Vázquez, Cristina L.; Cabruja, Matías Ezequiel; Sala, Claudia; Cazenave-Gassiot, Amaury; Blanco, Federico C.; Wenk, Markus R.; Bigi, Fabiana; Cole, Stewart T.; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto High cell density production of multimethyl-branched long-chain esters in Escherichia coli and determination of their physicochemical properties(BMC (part of Springer Nature), 2016-10-14) Menendez Bravo, Simón M.; Roulet, Julia; Sabatini, Martín; Comba, Santiago; Dunn, Robert; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaBackground: microbial synthesis of oleochemicals derived from native fatty acid (FA) metabolism has presented significant advances in recent years. Even so, native FA biosynthetic pathways often provide a narrow variety of usually linear hydrocarbons, thus yielding end products with limited structural diversity. To overcome this limitation, we took advantage of a polyketide synthase-based system from Mycobacterium tuberculosis and developed an Escherichia coli platform with the capacity to synthesize multimethyl-branched long-chain esters (MBE) with novel chemical structures. Results: with the aim to initiate the characterization of these novel waxy compounds, here, we describe the chassis optimization of the MBE producer E. coli strain for an up-scaled oil production. By carrying out systematic metabolic engineering, we improved the final titer to 138.1 ± 5.3 mg MBE L−1 in batch cultures. Fed-batch microbial fermentation process was also optimized achieving a maximum yield of 790.2 ± 6.9 mg MBE L−1 with a volumetric productivity of 15.8 ± 1.1 mg MBE (L h)−1. Purified MBE oil was subjected to various physicochemical analyses, including differential scanning calorimetry (DSC) and pressurized-differential scanning calorimetry (P-DSC) studies. Conclusions: the analysis of the pour point, DSC, and P-DSC data obtained showed that bacterial MBE possess improved cold flow properties than several plant oils and some chemically modified derivatives, while exhibiting high oxidation stability at elevated temperatures. These encouraging data indicate that the presence of multiple methyl branches in these novel esters, indeed, conferred favorable properties which are superior to those of linear esters.Ítem Acceso Abierto Identificación y caracterización de proteínas de estrés de Streptomyces coelicolor(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1999-03-29) Orsaria, Lelia María; Gramajo, Hugo CesarLas bacteria del genero Streptomyces presentan un complejo mecanismo de diferenciación morfológica: el mismo se inicia cuando el micelio sustrato comienza a autolisarse y de el emergen hifas aéreas multinucleadas, que darán lugar al micelio aéreo. Estas hifas aéreas continuaran con la diferenciación morfológica (enrollamiento, tabicacion, etc.) para dar finalmente numerosas esporas uninucleadas. En medio líquido muchas especies de Streptomyces no esporulan, sin embargo aun mantienen la capacidad de diferenciarse fisiológicamente, dando lugar a la producción de una gama muy amplia de metabolitos secundarios (antibióticos, antihelmínticos, antifúngicos, etc.) En medios de cultivos líquidos, ya sean mínimos o ricos, S coelicolor muestra una curva de crecimiento de tipo bifásica con cuatro fases claramente diferenciables; una primera fase de crecimiento logarítmico (CR1), luego una fase de transición (T) que antecede a una segunda fase de crecimiento logarítmico (CR2)….Ítem Desconocido Identification and physiological characterization of phosphatidic acid phosphatase enzymes involved in triacylglycerol biosynthesis in Streptomyces coelicolor(BMC, 2013-01-29) Comba, Santiago; Menendez Bravo, Simón M.; Arabolaza, Ana Lorena; Gramajo, Hugo CesarBackground: Phosphatidic acid phosphatase (PAP, EC 3.1.3.4) catalyzes the dephosphorylation of phosphatidate yielding diacylglycerol (DAG), the lipid precursor for triacylglycerol (TAG) biosynthesis. Despite the importance of PAP activity in TAG producing bacteria, studies to establish its role in lipid metabolism have been so far restricted only to eukaryotes. Considering the increasing interest of bacterial TAG as a potential source of raw material for biofuel production, we have focused our studies on the identification and physiological characterization of the putative PAP present in the TAG producing bacterium Streptomyces coelicolor. Results: We have identified two S. coelicolor genes, named lppα (SCO1102) and lppβ (SCO1753), encoding for functional PAP proteins. Both enzymes mediate, at least in part, the formation of DAG for neutral lipid biosynthesis. Heterologous expression of lppα and lppβ genes in E. coli resulted in enhanced PAP activity in the membrane fractions of the recombinant strains and concomitantly in higher levels of DAG. In addition, the expression of these genes in yeast complemented the temperature-sensitive growth phenotype of the PAP deficient strain GHY58 (dpp1lpp1pah1). In S. coelicolor, disruption of either lppα or lppβ had no effect on TAG accumulation; however, the simultaneous mutation of both genes provoked a drastic reduction in de novo TAG biosynthesis as well as in total TAG content. Consistently, overexpression of Lppα and Lppβ in the wild type strain of S. coelicolor led to a significant increase in TAG production. Conclusions: The present study describes the identification of PAP enzymes in bacteria and provides further insights on the genetic basis for prokaryotic oiliness. Furthermore, this finding completes the whole set of enzymes required for de novo TAG biosynthesis pathway in S. coelicolor. Remarkably, the overexpression of these PAPs in Streptomyces bacteria contributes to a higher productivity of this single cell oil. Altogether, these results provide new elements and tools for future cell engineering for next-generation biofuels production.Ítem Desconocido Identification of FadAB complexes involved in fatty acid β-oxidation in Streptomyces coelicolor and construction of a triacylglycerol overproducing strain(Frontiers Media, 2017-08-02) Menendez Bravo, Simón M.; Paganini, Julián; Avignone-Rossa, Claudio; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaÍtem Desconocido Metabolismo de la alantoína en Streptomyces coelicolor : relación entre metabolismo primario y secundario(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-03-10) Navone, Laura; Rodríguez, Eduardo José; Gramajo, Hugo CesarLas purinas y derivados como la alantoína son componentes abundantes del suelo, constituyendo una fuente de carbono y nitrógeno muy importante del hábitat natural de Streptomyces. En este trabajo de tesis se caracterizó la vía metabólica de degradación de alantoína como así también la regulación de la misma en S. coelicolor, mediante técnicas proteómicas, metabolómicas, bioquímicas, de biología molecular y de ingeniería genética. A partir de experimentos de proteómica se identificaron la mayor parte de las proteínas involucradas en la degradación de alantoína en esta bacteria. Posteriormente, se caracterizaron cuatro enzimas de esta vía, alantoinasa y alantoicasa, las cuales son esenciales para el crecimiento de la bacteria en medio con alantoína, e hidroxipiruvato isomerasa y tartronato semialdehído reductasa mediante técnicas bioquímicas y de ingeniería genética. Por otra parte, se identificó el regulador transcripcional negativo AllR del metabolismo de la alantoína en S. coelicolor. Ensayos in vitro permitieron identificar los sitios de unión de este regulador a tres promotores de la vía. Estos sitios se encuentran altamente conservados en otras especies de Streptomyces lo que denota una preservación en la regulación de esta ruta metabólica en este importante género bacteriano. Estos estudios permitieron proponer un modelo de regulación mediado por alantoato. A su vez, este trabajo permitió realizar una conexión importante entre el metabolismo primario de alantoína y el metabolismo secundario de producción de antibióticos en S. coelicolor. Por un lado, se evidenció que la degradación de alantoína provoca una marcada disminución de la producción de antibióticos. Mediante técnicas de metabolómica y análisis de compuestos nitrogenados en los cultivos se pudo determinar que el producto final de esta vía es amonio. El aislamiento de una mutante en el complejo ureasa, que no genera acumulación de amonio extracelular pero es capaz de producir niveles normales de antibióticos en medio con alantoína, permitió conectar el exceso de amonio con la inhibición de la producción de antibióticos durante el metabolismo de alantoína. Por otro lado, se estableció que el normal funcionamiento del regulador AllR es necesario para la producción de antibióticos en S. coelicolor, ya que la inactivación del gen allR afecta notablemente la síntesis de los mismos. La inactivación de genes que aumentan su expresión en ausencia del regulador AllR permitió identificar al gen hyi, que codifica para la enzima hidroxipiruvato isomerasa, como responsable de este efecto. La mutante AllR-Hyi- revierte la producción de metabolitos secundarios a los niveles de la cepa parental. Para agregar a esto, una mutación en el gen hyi en la cepa parental provoca un aumento de la síntesis de antibióticos y abre una puerta para estudios futuros como estrategia para aumentar la producción de compuestos bioactivos en esta especie bacteriana. Este trabajo expresa la importancia del estudio de las vías metabólicas primarias, no solo para aumentar el conocimiento general de este importante género bacteriano sino también debido a la interacción de estas vías con el metabolismo secundario y la posibilidad de una futura manipulación para beneficio del ser humano.Ítem Desconocido Mycobacterium tuberculosis FasR senses long fatty acyl-CoA through a tunnel and a hydrophobic transmission spine(Springer Nature, 2020-07-24) Lara, María Julia; Diacovich, Lautaro; Trajtenberg, Felipe; Larrieux, Nicole; Malchiodi, Emilio L.; Fernández, Marisa M.; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo Cesar; Buschiazzo, Alejandro; https://orcid.org/0000-0002-3339-0100; https://orcid.org/0000-0003-0427-5549; https://orcid.org/0000-0001-7501-3330; https://orcid.org/0000-0001-7668-0119; https://orcid.org/0000-0002-2509-6526Mycobacterium tuberculosis is a pathogen with a unique cell envelope including very long fatty acids, implicated in bacterial resistance and host immune modulation. FasR is a TetR-like transcriptional activator that plays a central role in sensing mycobacterial long-chain fatty acids and regulating lipid biosynthesis. Here we disclose crystal structures of M. tuberculosis FasR in complex with acyl effector ligands and with DNA, uncovering its molecular sensory and switching mechanisms. A long tunnel traverses the entire effector-binding domain, enabling long fatty acyl effectors to bind. Only when the tunnel is entirely occupied, the protein dimer adopts a rigid configuration with its DNA-binding domains in an open state, leading to DNA dissociation. The protein-folding hydrophobic core connects the two domains, and is completed into a continuous spine when the effector binds. Such a transmission spine is conserved in a large number of TetR-like regulators, offering insight into effector-triggered allosteric functional control.