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Ítem Acceso Abierto A coiled coil switch mediates cold sensing by the thermosensory protein DesK(Wiley, 2015-10-08) Saita, Emilio Adolfo; Abriata, Luciano Andrés; Tsai, Yi-Ting; Trajtenberg, Felipe; Lemmin, Thomas; Buschiazzo, Alejandro; Dal Peraro, Matteo; De Mendoza, Diego; Albanesi, DanielaThe thermosensor histidine kinase DesK from Bacillus subtilis senses changes in membrane fluidity initiating an adaptive response. Structural changes in DesK have been implicated in transmembrane signaling, but direct evidence is still lacking. On the basis of structure-guided mutagenesis, we now propose a mechanism of DesK-mediated signal sensing and transduction. The data indicate that stabilization/destabilization of a 2-helix coiled coil, which connects the transmembrane sensory domain of DesK to its cytosolic catalytic region, is crucial to control its signaling state. Computational modeling and simulations reveal couplings between protein, water and membrane mechanics. We propose that membrane thickening is the main driving force for signal sensing and that it acts by inducing helix stretching and rotation prompting an asymmetric kinase-competent state. Overall, the known structural changes of the sensor kinase, as well as further dynamic rearrangements that we now predict, consistently link structure determinants to activity modulation.Ítem Acceso Abierto Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar el metabolismo de colesterol : autofagia y efecto del aceite de kril(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2019-03-25) Battista, Bernabé; De Mendoza, Diego; Prez, Gastón M.El nematodo Caenorhabditis elegans es una poderosa herramienta para el estudio de diversas patologías. En nuestro laboratorio, se estudia como diferentes lípidos afectan el transporte de colesterol y su rol en el desarrollo reproductivo del gusano. El control del transporte de colesterol es crucial para la homeostasis fisiológica en la mayoría de las células eucariotas. Entre otros factores, el metabolismo del colesterol se encuentra asociado al proceso de reciclaje de componentes celulares conocido como autofagia. Se ha reportado que desregulaciones de la misma se asocian a diferentes enfermedades y desórdenes metabólicos. En este trabajo se estudio la influencia del metabolismo del colesterol sobre la autofagia en C. elegans. Encontrándose que la ausencia del colesterol produce una disminución del flujo autofágico y que el agregado externo del endocanabinoide 2-araquidonoil glicerol (2AG) restituye parcialmente el mismo. Asimismo se estudió el efecto del aceite de kril suplementado en la dieta, sobre la formación de dauers en cepas mutantes de C. elegans. Se descubrió que el aceite de kril contiene compuestos lipídicos que aumentan o inhiben la formación de dauers en C. elegans.Ítem Acceso Abierto Cannabinoids activate the insulin pathway to modulate mobilization of cholesterol in C. elegans(Public Library of Science, 2022-11) Hernández Cravero, Bruno; GallinoI, Sofía; Florman, Jeremy; Vranych, Cecilia V.; Diaz, Philippe; Elgoyhen, Ana Belén; AlkemaI, Mark J.; De Mendoza, DiegoÍtem Acceso Abierto Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-03-28) Saita, Emilio Adolfo; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela. subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que codifica para una Δ5 acil lípido desaturasa, la cual genera insaturaciones en los ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana plasmática modificando la fluidez de la misma. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar los eventos moleculares que tienen lugar en los segmentos transmembrana (TM) de DesK durante la detección de la señal de temperatura. La estrategia inicial que decidimos aplicar es la marcación de spin sitio-dirigida y posterior medición por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Dicha estrategia implica la unión de una sonda de spin a residuos de cisteína ubicados en diferentes posiciones de los segmentos TM, para estudiar la dinámica de los mismos en membranas artificiales. Este procedimiento requiere de la purificación de las proteínas en estudio a homogeneidad. Hasta la escritura de esta tesis, los estudios in vitro de DesK completa requerían de la utilización de un sistema de expresión in vitro. Aunque el sistema libre de células ha demostrado ser adecuado para la expresión de DesK, el mismo es muy costosos para ser usado de forma rutinaria. Por este motivo, en una primera instancia nos enfocamos en desarrollar un protocolo que permitiese purificar DesK a partir de cultivos bacterianos, en concentración y pureza suficientes para estudios biofísicos posteriores a un costo reducido. Con este fin, ensayamos diversas estrategias para la expresión y purificación de DesK, incluyendo diferentes vectores de expresión, medios de cultivo, condiciones de crecimiento para la expresión proteica, detergentes para la solubilización de las proteínas de membrana y diversas técnicas cromatográfícas. En función de los resultados obtenidos planificamos un protocolo que permitirán purificar DesK a homogeneidad en micelas de detergente. Resultados posteriores mostraron que la integración de DesK en liposomas permite incrementar la pureza de la misma, indicando que sería posible realizar la marcación con la sonda de spin de las proteínas purificadas en detergente, y posteriormente reconstituir las mismas en liposomas para las subsiguientes mediciones por EPR. Por otra parte, a partir de un análisis informático de covariancia de residuos identificamos pares de aminoácidos con alta probabilidad de interaccionar, ya sea por su cercanía en la estructura cuaternaria, o a través del esqueleto peptídico de DesK. En función a estos resultados seleccionamos posiciones de los segmentos TM que próximamente se reemplazarán por cisteínas, generando variantes de DesK con mutaciones puntuales, para su posterior marcación con la sonda de spin y mediciones de EPR. Estos experimentos ermitirían obtener información estructural y dinámica de los segmentos TM durante la detección de la señal de temperatura. En base a predicciones de estructura secundaria junto con el análisis de las estructuras cristalográficas de la porción catalítica soluble de DesK (DesKC) en distintos estados funcionales, identificamos un motivo de hélices enrolladas (2-HCC) que conecta el dominio TM sensor y el dominio catalítico soluble. La construcción de dos variantes de DesK en las cuales se estabilizó (DesKSTA) o desestabilizó (DesKDEST) el dominio 2-HCC mediante mutaciones puntuales permitió determinar que este motivo juega un rol importante en la regulación de las actividades catalíticas de DesK. Además, de acuerdo con medidas de actividad in vitro de DesK salvaje y DesKSTA insertadas en liposomas, y a ensayos de dinámica molecular de modelos atómicos de DesK salvaje, DesKDEST y DesKSTA, se propuso que en el estado fosfatasa las hélices del segmento TM5 podrían continuar formando un 2-HCC a través de toda la membrana, y que la hidratación de este motivo podría favorecer la apertura del mismo durante la transición al estado auto-quinasa. Por otra parte, se construyeron modelos del estado fosfatasa y auto-quinasa de una quimera funcional de DesK (MS-DesK), la cual posee un único segmento TM por monómero, generado por la fusión de los 17 residuos N-terminales de DesK a los 14 residuos C-terminales del TM5 de DesK. En función a ensayos de dinámica molecular de estos modelos embebidos en bicapas lipídicas de diferente espesor, se propuso un modelo para la detección y transmisión de la señal de temperatura por parte de MS-DesK. En este modelo, a 37 ºC la membrana se encuentra fluida y delgada, y MS-DesK adopta una conformación fosfatasa competente, caracterizada por el enrollamiento de las hélices TM formando un 2-HCC que se prolonga hacia el dominio citoplasmático. Los residuos polares del extremo N-terminal de los segmentos TM se encuentran hidratados debido a la apertura del 2-HCC generada por la bisagra formada entre Gly13 y Pro16, y los dominios de unión a ATP (ABDs) interaccionan fuertemente con el dominio de dimerización y fosforilación de histidina (DHp). Frente a una disminución de la temperatura, la membrana pierde fluidez y se ensancha, generando un movimiento de tijera en el N-terminal de los segmentos TM, favoreciendo la deshidratación de los residuos polares. Los segmentos TM sufren un estiramiento debido al cierre del extremo N-terminal y al segmento citoplasmático KERER que permanece anclado en la interface lípido-agua citoplasmática. Este estiramiento promueve la rotación de las hélices que a su vez provoca el desenrollamiento de los segmentos TM y del 2-HCC. El desenrollamiento estaría favorecido por la hidratación de los residuos polares que se orientan hacia el núcleo del CC. Esta rotación se transmite al DHp, que ahora esconde los residuos hidrofóbicos que le permitían interaccionar con los ABDs. Finalmente, los ABDs quedan libres favoreciendo el estado auto-quinasa competente.Ítem Acceso Abierto Cerulenin inhibits unsaturated fatty acids synthesis in Bacillus subtilis by modifying the input signal of DesK thermosensor(Wiley, 2014-04-09) Porrini, Lucía; Cybulski, Larisa Estefanía; Altabe, Silvia Graciela; Mansilla, María Cecilia; De Mendoza, DiegoBacillus subtilis responds to a sudden decrease in temperature by transiently inducing the expression of the des gene encoding for a lipid desaturase, Δ5-Des, which introduces a double bond into the acyl chain of preexisting membrane phospholipids. This Δ5-Des-mediated membrane remodeling is controlled by the cold-sensor DesK. After cooling, DesK activates the response regulator DesR, which induces transcription of des. We show that inhibition of fatty acid synthesis by the addition of cerulenin, a potent and specific inhibitor of the type II fatty acid synthase, results in increased levels of short-chain fatty acids (FA) in membrane phospholipids that lead to inhibition of the transmembrane-input thermal control of DesK. Furthermore, reduction of phospholipid synthesis by conditional inactivation of the PlsC acyltransferase causes significantly elevated incorporation of long-chain FA and constitutive upregulation of the des gene. Thus, we provide in vivo evidence that the thickness of the hydrophobic core of the lipid bilayer serves as one of the stimulus sensed by the membrane spanning region of DesK.Ítem Acceso Abierto Corrigendum: Identification of novel thermosensors in gram-positive pathogens(2022-08-31) Fernández, Pilar; Díaz, Alejandra Raquel; Ré, María Florencia; Porrini, Lucía; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela; Mansilla, María CeciliaÍtem Acceso Abierto Defining Caenorhabditis elegans as a model system to investigate lipoic acid metabolism(ASBMB, 2021-01-04) Lavatelli, Antonela; De Mendoza, Diego; Mansilla, María Cecilia; https://orcid.org/0000-0002-1444-8661Lipoic acid (LA) is a sulfur-containing cofactor that covalently binds to a variety of cognate enzymes that are essential for redox reactions in all three domains of life. Inherited mutations in the enzymes that make LA, namely lipoyl synthase, octanoyltransferase, and amidotransferase, result in devastating human metabolic disorders. Unfortunately, because many aspects of this essential pathway are still obscure, available treatments only serve to alleviate symptoms. We envisioned that the development of an organismal model system might provide new opportunities to interrogate LA biochemistry, biology, and physiology. Here we report our investigations on three Caenorhabditis elegans orthologous proteins involved in this post-translational modification. We established that M01F1.3 is a lipoyl synthase, ZC410.7 an octanoyltransferase, and C45G3.3 an amidotransferase. Worms subjected to RNAi against M01F1.3 and ZC410.7 manifest larval arrest in the second generation. The arrest was not rescued by LA supplementation, indicating that endogenous synthesis of LA is essential for C. elegans development. Expression of the enzymes M01F1.3, ZC410.7, and C45G3.3 completely rescue bacterial or yeast mutants affected in different steps of the lipoylation pathway, indicating functional overlap. Thus, we demonstrate that, similarly to humans, C. elegans is able to synthesize LA de novo via a lipoyl-relay pathway, and suggest that this nematode could be a valuable model to dissect the role of protein mislipoylation and to develop new therapies.Ítem Embargo Determinación del mecanismo de acción de los endocannabinoides en Caenorhabditis elegans(2023) Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Binolfi, AndrésEl colesterol es un lípido esencial constituyente de las membranas de las células eucariotas. Su función principal es estructural pero también lleva a cabo funciones como molécula de señalización. Por ello, la regulación del metabolismo colesterol es crucial para el normal funcionamiento de las células. En el nematodo Caernohabditis elegans (C. elegans), existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. En los últimos años, se ha propuesto que un conjunto de lípidos denominados N-aciletanolaminas (NAEs), antagonizan la detención del desarrollo de los nematodos [1]. Más recientemente, nuestro grupo de laboratorio demostró que otra clase de lípidos, los endocannabinoides (eCBs), regulan el ciclo de vida de C. elegans mediante la promoción de la movilización de colesterol [2]. Sin embargo, el mecanismo y las vías de señalización activadas por los eCBs para movilizar colesterol no son conocidas. Adicionalmente, numerosos trabajos sugieren un rol directo de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas [3] y cardiovasculares [4], sugiriendo que algunos ácidos grasos (AGs) regulan el desarrollo de diversas enfermedades. A pesar de que se ha avanzado mucho en el entendimiento del rol que juegan los lípidos para el mantenimiento de la homeostasis celular, su funcionalidad como moléculas de señalización esta superficialmente estudiada. Por este motivo, en este trabajo de tesis tratamos de elucidar como los eCBs actúan como moléculas de señalización promoviendo el transporte del colesterol en C. elegans. Pudimos identificar diferentes proteínas involucradas en la vía de señalización activada por 2-O-araquidonoil glicerol (2-AG), eCB derivado de ácido araquidónico (20:4 ω-6) [5], que estimula el transporte de colesterol. Nuestros experimentos sugieren que el 2-AG estimula la movilización de colesterol por un mecanismo dependiente de los receptores del tipo TRPV (de sus siglas en inglés: Transient Receptor Potential Vainoillid), la liberación de vesículas de núcleo denso como también de la vía de señalización de la insulina Por otra parte, desarrollamos metodologías de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) como metodología para el estudio del metabolismo de AGs in vivo en C. elegans. Este procedimiento nos permitió estudiar cómo se modifican los AGs y otros metabolitos en diferentes cepas mutantes y así identificar nuevos componentes involucrados en la vía de señalización desencadenada por el ortólogo a los receptores de adiponectina (AdipoR1 y AdipoR2), PAQR-2, en condiciones de baja temperatura [6–8]. Estos descubrimientos demuestran, por un lado, de forma precisa que vías de señalización son activadas por 2-AG en la regulación del tráfico de colesterol y, por el otro, aportan, claridad para el estudio del rol de los AGs como moléculas de señalización.Ítem Acceso Abierto Endocannabinoid 2-arachidonoyl glycerol increases the transcription of daf-7 in ASI neurons(Caltech Library, 2018-10-19) Galles, Celina; Prez, Gastón M.; De Mendoza, DiegoThis article investigates the effect of the endocannabinoid 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) on the expression of the daf-7 gene in ASI neurons of nematodes. It demonstrates that daf-7 expression levels increase notably when nematodes are exposed to 2-AG. This observation is supported by fluorescence microscopy images showing elevated GFP signal in ASI neurons treated with 2-AG compared to control groups. Statistical analysis confirms a significant difference in daf-7 expression between the 2-AG treatment and solvent control conditions. The study conducted three independent experiments, analyzing a total of 70 ASI neurons for each condition. Regarding the methods, worms were cultured on solid NGM plates supplemented with bacteria and specific supplements for each experimental condition. Daf-7 expression was monitored in synchronized L1 larvae fed with Escherichia coli supplemented with either 2-AG or carrier solvent. Fluorescence microscopy was utilized to visualize GFP intensity in ASI neurons, and image analysis software quantified the data. The study concludes a robust increase in daf-7 expression in response to 2-AG treatment.Ítem Acceso Abierto Endocannabinoides derivados de ácido araquidónico son esenciales para la movilización de colesterol en el nematodo Caenorhabditis elegans(2020) Prez, Gastón M.; De Mendoza, Diego; Galles, CelinaLa correcta homeostasis de colesterol es crucial para el normal funcionamiento celular. Asimismo, el transporte de este esterol es sumamente importante para garantizar un equilirbio metabólico adecuado. En el nematodo Caernohabditis elegans, existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. La ausencia de estas hormonas produce un arresto larval o estadio de supervivencia denominado dauer. Por lo tanto, el correcto transporte de colesterol a los sitios de síntesis de estos ADs garantiza el desarrollo reproductivo de los nematodos. Recientemente, se ha descripto que C. elegans posee una nueva clase de glicoesfingolípidos denominados PEGCs, los cuales serían necesarios para la movilización de colesterol desde las reservas internas. En esta tesis logramos identificar otro grupo de lípidos involucrados en este proceso. Hemos descripto como cepas de nematodos deficientes en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) se arrestan en estadio dauer debido a una deficiencia en el transporte de colesterol. Este efecto esta correlacionado con la insuficiencia de endocannabinoides derivados de los PUFAs. La suplementación con los endocannabinoides 2- araquidonoil glicerol (2-AG) y anandamida (AEA), ambos derivados de ácido araquidónico, logró rescatar el arresto en dauer causado por la depleción de PUFAs. Asimismo, estos endocannabinoides son capaces de evitar el arresto dauer en gusanos mutantes en las proteínas transportadoras de colesterol NCR-1 y NCR-2. Las mismas son ortólogas a la proteína NPC-1 en humanos, la cual existe con pérdida de función en personas con síndrome Niemann-Pick. Por último, demostramos que los endocannabinoides 2-AG y AEA actúan a través de una vía paralela a la que actúan los PEGCs. Estos descubrimientos revelan una nueva función para los endocannabinoides, involucrándolos en la regulación del tráfico de colesterol.Ítem Acceso Abierto Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves(Nature, 2018-04-23) Galles, Celina; Prez, Gastón M.; Penkov, Sider; Boland, Sebastian; Porta, Exequiel Oscar Jesús; Altabe, Silvia Graciela; Labadie, Guillermo Roberto; Schmidt, Ulrike; Knölker, Hans-Joachim; Kurzchalia, Teymuras V.; De Mendoza, DiegoÍtem Acceso Abierto Estudio del Mecanismo de termodetección de DesK, una histidina quinasa termosensora de Bacillus subtilis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-10-24) Inda, María Eugenia; Cybulski, Larisa Estefanía; De Mendoza, DiegoEl cambio en la temperatura ambiental afecta a las reacciones biológicas y las células deben adaptarse. Un ejemplo de ello es la regulación de la fluidez de la membrana. Las bacterias pueden remodelar la fluidez de la bicapa con precisión a través de la incorporación de una mayor proporción de ácidos grasos insaturados cuando la temperatura de crecimiento disminuye, esto altera el ordenamiento de la bicapa lipídica y optimiza la fluidez. Pero, ¿cómo pueden las células "sensar" la fluidez de la membrana? La histidina quinasa DesK de Bacillus subtilis es el ejemplo paradigmático de un sensor térmico capaz de remodelar la fluidez de la membrana cuando la temperatura cae por debajo de 30 ° C, proporcionando un sistema para investigar el mecanismo de adaptación térmica. Entonces, ¿cuál es el mecanismo por el cual DesK es capaz de detectar cambios de temperatura y cómo puede convertir esta señal física externa en una respuesta biológica interna? Esta tesis estudia cómo la información térmica se integra, procesa y transduce para controlar la expresión génica y la intrigante posibilidad de que las deformaciones inducidas por la temperatura en la membrana celular actúen como reguladoras alostéricas. Como responsable del control por temperatura, encontramos una inestabilidad incorporada al sistema causada por un grupo de residuos hidrofílicos situados cerca del extremo N-terminal del primer segmento transmembrana, presumiblemente justo debajo de la interfase lípido/agua. Estos residuos enterrados en la fase lipídica a baja temperatura son capaces de bucear a la fase acuosa, estabilizando la posición del segmento transmembrana como una boya. En el extremo C-terminal de la parte transmembrana se detectó otro motivo sensible a la temperatura: el Cierre de Serina. El grosor de la membrana controla el estado de señalización del sensor al dictar el nivel de hidratación de este motivo hidrofílico metaestable. Nuestros resultados revelaron que DesK funciona como un dímero, en el que el motivo boya N-terminal actúa junto con un motivo hidrófilo C-terminal para causar una reorientación de las hélices en respuesta a cambios en el espesor de la membrana, dirigiendo la activación proteica. Sin embargo, la pregunta subyacente aún se mantiene: ¿Cómo puede la información detectada por la región transmembrana convertirse en un reordenamiento en el dominio catalítico citoplasmático para controlar la actividad de DesK? Aquí, identificamos una "región linker" implicada en la transmisión de la señal que conecta el transmembrana con el dominio citoplasmático. El linker adopta dos estados conformacionales en respuesta a los cambios de espesor de la membrana dependientes de la temperatura: (i) random coil, unido a las cabezas de los fosfolípidos, promoviendo el estado de la fosfatasa o (ii) no unido, formando una hélice continua que atraviesa la región de la membrana hasta el citoplasma, promoviendo así el estado quinasa. Nuestros resultados sostienen la idea de que el linker está dotado de una dualidad conformacional hélice/random coil que permite que se comporte como un interruptor de transmisión, con una discontinuidad en la hélice disminuyendo la relación de actividad quinasa/fosfatasa, como se requiere para modular la respuesta de DesK.Ítem Acceso Abierto Identification of Novel Thermosensors in Gram-Positive Pathogens(Frontiers Media, 2020-11-26) Fernández, Pilar; Díaz, Alejandra Raquel; Ré, María Florencia; Porrini, Lucía; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela; Mansilla, María CeciliaÍtem Acceso Abierto Interhelical h-bonds modulate the activity of a polytopic transmembrane kinase(MDPI, 2021) Almada, Juan Cruz; Bortolotti, Ana; Ruysschaert, Jane Marie; De Mendoza, Diego; Cybulski, Larisa EstefaníaÍtem Acceso Abierto Regulación de la síntesis de lípidos en Bacillus subtilis durante la adaptación a bajas temperaturas de crecimiento(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2001) Aguilar, Pablo; De Mendoza, DiegoEn este trabajo de Tesis se ha identificado y caracterizado un conjunto de genes que pertenece a un circuito regulatorio involucrado en la percepción y respuesta al frío en la bacteria Gram positiva B. subtilis. Para comenzar a elucidar las bases moleculares de la percepción de la temperatura en bacterias se identificó el gen que codifica para la actividad desaturasa frío inducible de B. subtilis. El estudio de este gen, denominado des, reveló que es monocistrónico y que B. subtilis posee una única actividad desaturasa, del tipo A5 acil lípido desaturasa. Se determinó que la expresión de des se encuentra estrictamente regulada por la temperatura de crecimiento. A 37ºC su transcripción se encuentra reprimida mientras que al descender la temperatura ambiente se induce su transcripción de manera transitoria. A diferencia de la mayoría de los genes descriptos como frío-inducibles en bacterias, el gen des no es regulado a través de la estabilidad de su ARNm. La regulación del gen des por temperatura es de carácter exclusivamente transcripcional. En la búsqueda de genes involucrados en la regulación del gen des, se identificó un operón, denominado desKR, cuyo dos genes, desKR y desR, resultaron ser esenciales para la inducción por frío del gen des. Este operón codifica para proteínas con homología a las de los sistemas reguladores de dos componentes. DesR, es una proteína soluble que se une específicamente al promotor del gen des. Desk presenta homología con histidin quinasas de membrana y la evidencia experimental recogida permite postular que presenta actividades fosfatasa y quinasa sobre DesR en función de la temperatura ambiente. Finalmente, se determinó que los AGIs constituyen una señal negativa en la inducción por frío del gen des. Por lo tanto un circuito regulatorio formado por las proteínas DesK y DesR y los AGIs constituye un nuevo mecanismo de control de la expresión génica a bajas temperaturas.Ítem Acceso Abierto Revisiting the cell biology of the acyl-ACP:phosphate transacylase PlsX suggests that the phospholipid synthesis and cell division machineries are not coupled in Bacillus subtilis(Wiley, 2016-05-06) Sastre, Diego Emiliano; Bisson-Filho, Alexandre; De Mendoza, Diego; Gueiros-Filho, Frederico J.PlsX is a central enzyme of phospholipid synthesis in bacteria, converting acyl-ACP to acyl-phosphate on the pathway to phosphatidic acid formation. PlsX has received attention because it plays a key role in the coordination of fatty acid and phospholipid synthesis. Recently, PlsX was also suggested to coordinate membrane synthesis with cell division in Bacillus subtilis. Here, we have re-investigated the cell biology of PlsX and determined that the enzyme is uniformly distributed on the membrane of most cells, but occasionally appears as membrane foci as well. Foci and homogenous patterns seem freely interconvertible but the prevalence of the uniform staining suggests that PlsX does not need to localize to specific sites to function correctly. We also investigated the relationship between PlsX and the divisome. In contrast to previous observations, PlsX's foci showed no obvious periodicity of localization and did not colocalize with the divisome. Furthermore, depletion of PlsX did not affect cell division if phospholipid synthesis is maintained by an alternative enzyme. These results suggest that coordination between division and membrane synthesis may not require physical or functional interactions between the divisome and phospholipid synthesis enzymes.Ítem Acceso Abierto Synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans(JoVE, 2019-09-21) Fernández de Luco, Julia; Prez, Gastón M.; Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Labadie, Guillermo RobertoÍtem Acceso Abierto The phosphatidic acid pathway enzyme PlsX plays both catalytic and channeling roles in bacterial phospholipid synthesis(American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2020-01-09) Sastre, Diego Emiliano; Pulschen, André A.; Basso , Luis G.M.; Benites Pariente, Jhonathan S.; Marques Netto, Caterina G.C.; Machinandiarena, Federico; Albanesi, Daniela; Navarro, Marcos V.A.S.; De Mendoza, Diego; Gueiros-Filho, Frederico J.PlsX is the first enzyme in the pathway that produces phosphatidic acid in Gram-positive bacteria. It makes acylphosphate from acyl-acyl carrier protein (acyl-ACP) and is also involved in coordinating phospholipid and fatty acid biosyntheses. PlsX is a peripheral membrane enzyme in Bacillus subtilis, but how it associates with the membrane remains largely unknown. In the present study, using fluorescence microscopy, liposome sedimentation, differential scanning calorimetry, and acyltransferase assays, we determined that PlsX binds directly to lipid bilayers and identified its membrane anchoring moiety, consisting of a hydrophobic loop located at the tip of two amphipathic dimerization helices. To establish the role of the membrane association of PlsX in acylphosphate synthesis and in the flux through the phosphatidic acid pathway, we then created mutations and gene fusions that prevent PlsX's interaction with the membrane. Interestingly, phospholipid synthesis was severely hampered in cells in which PlsX was detached from the membrane, and results from metabolic labeling indicated that these cells accumulated free fatty acids. Because the same mutations did not affect PlsX transacylase activity, we conclude that membrane association is required for the proper delivery of PlsX's product to PlsY, the next enzyme in the phosphatidic acid pathway. We conclude that PlsX plays a dual role in phospholipid synthesis, acting both as a catalyst and as a chaperone protein that mediates substrate channeling into the pathway.Ítem Acceso Abierto The role of cell-envelope synthesis for envelope growth and cytoplasmic density in Bacillus subtilis(Oxford University Press, 2022-07-26) Kitahara, Yuki; Oldewurtel, Enno R.; Wilson, Sean; Sun, Yingjie; Altabe, Silvia Graciela; De Mendoza, Diego; Garner, Ethan C.; Van Teeffelen, Sven; http://orcid.org/0000-0001-8034-9058; http://orcid.org/0000-0002-2813-0259; http://orcid.org/0000-0002-7216-9804; http://orcid.org/0000-0002-1309-753X; http://orcid.org/0000-0003-0141-3555; http://orcid.org/0000-0002-0877-1294All cells must increase their volumes in response to biomass growth to maintain intracellular mass density within physiologically permissive bounds. Here, we investigate the regulation of volume growth in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. To increase volume, bacteria enzymatically expand their cell envelopes and insert new envelope material. First, we demonstrate that cell-volume growth is determined indirectly, by expanding their envelopes in proportion to mass growth, similarly to the Gram-negative Escherichia coli, despite their fundamentally different envelope structures. Next, we studied, which pathways might be responsible for robust surface-to-mass coupling: We found that both peptidoglycan synthesis and membrane synthesis are required for proper surface-tomass coupling. However, surprisingly, neither pathway is solely rate-limiting, contrary to wide-spread belief, since envelope growth continues at a reduced rate upon complete inhibition of either process. To arrest cell-envelope growth completely, the simultaneous inhibition of both envelope-synthesis processes is required. Thus, we suggest that multiple envelope-synthesis pathways collectively confer an important aspect of volume regulation, the coordination between surface growth, and biomass growth.Ítem Acceso Abierto Transmembrane prolines mediate signal sensing and decoding in Bacillus subtilis DesK histidine kinase(American Society for Microbiology, 2019-11-26) Fernández, Pilar; Porrini, Lucía; Albanesi, Daniela; Abriata, Luciano Andrés; Dal Peraro, Matteo; De Mendoza, Diego; Mansilla, María Cecilia