Examinando por Autor "Danielli, Mauro"
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Ítem Acceso Abierto Adenovirus-mediated human aquaporin-1 expression in hepatocytes improves lipopolysaccharide-induced cholestasis(John Wiley & Sons Inc, 2017-12) Marrone, Julieta; Danielli, Mauro; Gaspari, César Ismael; Marinelli, Raúl A.; http://orcid.org/0000-0003-2934-8863Lipopolysaccharides (LPS) are known to cause cholestasis in sepsis. There is evidence that a defective expression of canalicular aquaporin water channels contributes to bile secretory failure in LPS-induced cholestasis. Thus, we studied whether the hepatic adenovirus-mediated transfer of human aquaporin-1 gene (haqp1) can improve the cholestasis induced by LPS. Adenoviral vector encoding hAQP1 (AdhAQP1) or control vector was administered to rats by retrograde intrabiliary infusion. Hepatocyte canalicular hAQP1 expression was assessed by liver immunostaining and immunoblotting in purified plasma membranes. LPS reduced bile flow and biliary bile acid excretion by 30% and 45%, respectively. AdhAQP1-treatment normalized both bile flow and biliary bile acid excretion in LPS-induced cholestasis. Moreover, markedly elevated serum bile acid levels in cholestatic rats, were also normalized with the AdhAQP1 hepatic transduction. Bile flow and serum or biliary bile acids in normal rats were not significantly altered by AdhAQP1. AdhAQP1 delivery unaffected the downregulated protein expression of canalicular bile salt export pump (BSEP/ABCB11) in cholestasis, but improved its transport activity restoring reduced canalicular cholesterol content. Our data suggest that the adenovirus-mediated hepatocyte hAQP1 expression improves LPS-induced cholestasis in rats by stimulating the BSEP/ABCB11-mediated biliary bile acid excretion; a finding that might contribute to the understanding and treatment of sepsis-associated cholestatic diseases.Ítem Acceso Abierto Data of H2O2 release from AQP8-knockdown rat hepatocyte mitochondria(Elsevier, 2019-03-06) Danielli, Mauro; Marrone, Julieta; Capiglioni, Alejo M.; Marinelli, Raúl A.Ítem Acceso Abierto Rol de la aquaporina-8 mitocondrial en la regulación de la biosíntesis hepática del colesterol(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2019-03-22) Danielli, Mauro; Marinelli, Raúl A.La aquaporina-8 (AQP8) es un canal transmembrana multifuncional que facilita el pasaje del peróxido de hidrógeno y amoníaco, además de agua. AQP8, como una proteína de 28 kDa no glicosilada, se expresa en la membrana interna mitocondrial de los hepatocitos y algunas otras células. La AQP8 mitocondrial (mtAQP8) del hepatocito puede funcionar como una peroxiporina facilitando la liberación mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2). En hepatocitos, el colesterol puede activar o reprimir genes implicados en su vía biosintética a través de la unión a elementos regulados por esteroles (SRE) de factores nucleares SREBPs. Los SREBPs interactúan con las regiones promotoras SRE de genes que codifican las enzimas colesterogénicas, por ejemplo, la enzima clave 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR). AQP8 ha sido identificado, por análisis de microarrays, como un gen putativo de respuesta a colesterol siendo posiblemente blanco de los factores nucleares SREBP en hígado de ratón. Además, el análisis del promotor del gen de AQP8 indica que también posee elementos de respuesta a los factores nucleares SREBP. Por otra parte, se ha reportado que el H2O2 estimula la síntesis de colesterol mediada por SREBPs en las células hepáticas, así nuestra hipótesis es que mtAQP8, a través de su rol facilitador de la liberación del H2O2 mitocondrial (mtH2O2), juega un papel en la regulación de la biosíntesis de colesterol del hepatocito mediada por SREBP. Inicialmente estudiamos el efecto de alteraciones en el contenido de colesterol sobre la expresión de mtAQP8 en células humanas derivadas de hepatocitos. Células Huh7 fueron cargadas con colesterol utilizando el complejo metil-β-ciclodextrina (mβCD):colesterol, y depletadas de colesterol con mβCD en ausencia de lipoproteínas. El incremento del colesterol celular inhibió la activación proteolítica del SREBP-2, y como consecuencia de ello, se redujo significativamente la expresión, a nivel ARNm y proteína, de la enzima HMGCR. En estas condiciones, la expresión de mtAQP8, tanto del ARNm como de la proteína, disminuyó significativamente. La disminución a nivel proteico en la expresión de mtAQP8 fue también observada mediante microscopía confocal. Por el contrario, una reducción en el colesterol celular activó la proteólisis del SREBP-2, y aumentó la expresión (ARNm y proteína) de la HMGCR. La expresión de mtAQP8 incrementó significativamente a nivel ARNm y proteína lo cual también fue observado mediante microscopía confocal. En conclusión, nuestros datos sugieren que el colesterol regula transcripcionalmente la expresión hepática de la mtAQP8 a través de SREBPs. En otra etapa de este trabajo estudiamos si un aumento o disminución en la expresión de mtAQP8 podría modular la colesterogénesis en el hepatocito. Primeramente establecimos un knockdown de AQP8 en hepatocitos de rata en cultivo y en células Huh-7. Las células hepáticas con knockdown de mtAQP8 mostraron una disminución significativa de la biosíntesis de novo del colesterol. En concordancia, la expresión tanto de SREBP-2 como de su gen diana HMGCR, se vieron disminuidos de manera significativa. Cuando la expresión de mtAQP8 fue aumentada luego de exponer los cultivos de hepatocitos de rata a un adenovector codificante para la AQP8 humana (hAQP8), la biosíntesis de colesterol aumentó de manera significativa. En estas condiciones, SREBP-2 y HMGCR también aumentaron su expresión. Además, realizamos ensayos in vitro para cuantificar la liberación de mtH2O2 la cual se observó significativamente aumentada en mitocondrias provenientes de hepatocitos con sobre-expresión de mtAQP8 y disminuida en mitocondrias provenientes de hepatocitos con knockdown de mtAQP8. En base a esto, decidimos tratar los hepatocitos con Mitotempo, un antioxidante específico de mitocondria. Bajo estas condiciones se previno el aumento en la liberación de mtH2O2 así como el aumento en la síntesis de colesterol observado en la sobre-expresión de mtAQP8. En conclusión, nuestros resultados sugieren que mtAQP8 vía el H2O2 derivado de las mitocondrias, participa en la colesterogénesis controlada por SREBP en los hepatocitos.