Examinando por Autor "Crocenzi, Fernando A."
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Ítem Acceso Abierto Adaptive downregulation of Cl- /HCO3 - exchange activity in rat hepatocytes under experimental obstructive cholestasis(Public Library of Science (PLOS), 2019-02-21) Miszczuk, Gisel Sabrina; Banales, Jesus M.; Zucchetti, Andrés E.; Pisani, Gerardo Bruno; Boaglio, Andrea C.; Saez, Elena; Medina, Juan F.; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.Ítem Acceso Abierto Biología celular del proceso de internalización endocítica de transportadores hepatocelulares canaliculares en colestasis por estrógenos(no disponible, 2016-12-16) Miszczuk, Gisel Sabrina; Crocenzi, Fernando A.; Roma, Marcelo GabrielEl estradiol-β-D-glucuronido (E17G) es un metabolito endógeno del estradiol cuyos niveles plasmáticos aumentan durante el embarazo, habiendo sido postulado como responsable de la patogénesis de la colestasis intrahepática que ocurre en las mujeres susceptibles embarazadas. La administración de E17G a ratas hembras produce una colestasis dosis-dependiente, aguda y reversible, afectando las fracciones dependientes e independientes de sales biliares del flujo biliar. nuestro grupo demostró que la alteración secretora bibliar inducida por E17G en la rata es críticamente dependiente de la endocitosis de transportadores hepatocelulares canaliculares claves para la formación de bilis, como Bsep Mrp2. Asimismo demostramos que este fenómeno está mediado por la activación de varias vías de señalización intracelular, como aquellas dependientes de REα-cPKC-ERK1/2, PI3K-Akt-p38MAPK y GPR30-AC-PKA. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la endocitosis de los transportadores canaliculares es desconocido, y su esclarecimiento representa el objetivo principal de esta tesis. En una primera etapa, y ante la necesidad de contar con un modelo hepatocelular polarizado para el estudio de estos mecanismos, hemos validado el cultivo primario de hepatocitos de rata en sándwich de colágeno (CPHS) para el estudio de drogas que afectan la formación de bilis a través de la inducción de endocitosis de transportadores canaliculares. Tratando los CPHS con los agentes coléstasico E17G y taurolitocolato, así copmo con el compuesto colerético y anticolestásico DBAMPc, demostramos la utilidad de este modelo in vitro para detectar y cuantificar cambios en la secreción canalicular tanto de tipo colestásico como colerético, así como los cambios en la localización intracelular de transportadores canaliculares causales de dichas alteraciones funcionales. En la segunda etapa, el uso de inhibidores especificos de las vías endocíticas depenmdientes de clatrina y de caveolinas en duplas aisladas de hepoatocitos aportó evidencia preelimiar que E17G induce la endocitosis de Bsep y Mrp2 por un mecanismo dependiente de clatrina. Se obtuvo evidencia adicional de este mecanismo en hígados aislados y perfundidos, donde un inhibidor especifico de esta vía endocítica, monodansilcadaverina, previno la caída en el flujo biliar y la excreción biliar de sustrato de Bsep y Mrp2, así como la endocitosis de dichos transportadores evaluada por microscopía confocal. A modo confirmatorio de la dependencia de clatrina en la endocitosis de estos transportadore inducida por E17G, observamos que el bloque de esta vía mediante knock-down por RNA interferente de la expresión de AP2 (componente clave de la maquinaria endocítica dependiente de clatrina) en CPHS, llevó a una prevención completa de la función de transporte y de la endocitosis Bsep y Mrp2. En forma adicional, demostramos que E17G altera la localización de membrana de estos transportadores (originalmente enriquecidos en microdominois raft, ricos en colesterol y caveolina), llevando a un enriquecimiento de los mismos en microdominios canaliculares ricos en clatrina (no rafts), desde donde puede producirse la endocitosis dependiente de la misma. Por ultimo, como una primera aproximación a la identificación de los blancos celulares de aquellas proteínas quinasas activadas por E17G que conducen en última instancia a la endocitosis dependiente de clatrina de los transportadores canaliculares, se realizaron estudios de fosfoproteómica para identificar proteínas que modifiquen su grado de fosforilación frente al tratamiento con este estrógeno. Esto llevo a la identificación de numerosas proteínas que incrementan su fosforilación por E17G, dejando abierta así la posibilidad de realizar experimentos tendientes a evaluar su posible rol como intermediarios entre las vías de señalización pro-colestásicas y el proceso final de endocitosis de transportadores canaliculares conducente a la alteración colestásica.Ítem Acceso Abierto G-protein-coupled receptor 30/adenylyl cyclase/protein kinase A pathway is involved in estradiol 17ß-D-glucuronide-induced cholestasis(Wiley, 2014-10) Zucchetti, Andrés E.; Barosso, Ismael R.; Boaglio, Andrea C.; Basiglio, Cecilia Lorena; Miszczuk, Gisel Sabrina; Larocca, María Cecilia; Ruiz, María Laura; Davio, Carlos A.; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.; Sánchez Pozzi, Enrique JuanÍtem Acceso Abierto Mecanismos intracelulares involucrados en la colestasis por estrógenos : rol del receptor de estrógenos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-03-18) Barosso, Ismael R.; Sánchez Pozzi, Enrique Juan; Crocenzi, Fernando A.El estradiol 17ß-D-glucurónido (E17G) induce colestasis aguda en la rata con internalización endocítica de los transportadores canaliculares, Abcb11 y Abcc2. Las vías de señalización de la proteína quinasa clásica (PKCc) y las vías de señalización de PI3K juegan roles complementarios en la colestasis por E17G, también se ha reportado la participación de la vía GPR30/AC/PKA. Ya que el estradiol no conjugado es capaz de activar estas vías de señalización a través de la activación del receptor de estrógeno alfa (REα), en este trabajo de Tesis se postula como hipótesis la participación de REα en las manifestaciones colestásicas del E17G en el modelo de Hígado Aislado y Perfundido de rata (HAPR) como así también en modelos de cultivos primario de hepatocitos de rata. En el modelo de HAPR y en cultivo primario de hepatocitos, el E17G activó el REα. En HAPR, E17G disminuyó el flujo biliar y las excreciones de dinitrofenilglutation, y taurocolato (sustratos específicos de Abcc2 y Abcb11, respectivamente) en aproximadamente 60 %; la pre-administración de ICI (inhibidor de REα) previno en forma casi completa estas disminuciones. En el modelo de duplas aisladas de hepatocitos de rata (DAHR), un modelo polarizado de hepatocitos en cultivo, el tratamiento con E17G disminuyó la acumulación vacuolar canalicular de colil-glicilamido fluoresceína (sustrato de Abcb11) con un CI50 de 91±1 μM. El tratamiento con ICI aumentó la CI50 a 102±1 μM, y similarmente previno la disminución de la acumulación vacuolar canalicular del sustrato de Abcc2, glutatión-metil fluoresceína, con una CI50 de 104±1μM sin ICI y un CI50 de 164±2 μM en presencia del inhibidor. El inhibidor ICI también previno completamente la internalización endocítica de los transportadores canaliculares Abcb11 y Abcc2. La participación de REα se confirmó a través del uso de knock-down del REα en cultivo primario de hepatocitos en configuración “sándwich” (HRCS) donde se observó que la disminución de la expresión de REα previno la internalización de ambos transportadores cuando las células fueron tratadas con E17G. En el modelo de DAHR, la protección de ICI tuvo un efecto sumatorio cuando fue probado conjuntamente con Wortmanina, un inhibidor de PI3K pero no se observó un efecto sumatorio con el inhibidor Gö6976, un inhibidor de PKCc; sugiriendo que REα forma parte de la vía de señalización de PKCc pero no de la vía de señalización de PI3K. Un análisis más detallado de las activaciones REα y PKCc inducida por E17G, demostró que ICI no afecta a la activación PKCc mientras que Gö6976 impidió la activación de REα, lo que indica que la activación de PKCc (evaluada a través de la activación de PKCα) precede a la activación de REα. Por otro lado, también se observó mediante la técnica de western blot en cultivo primario de hepatocitos que la activación de REα ocurriría independientemente de la vía GPR30/AC/PKA y que probablemente la fosforilación de sustratos de PKA (o su mantenimiento en estado fosforilado) depende de la activación de REα. Conclusión: el REα está implicado en la falla secretora biliar inducida por E17G y su activación ocurre luego de la activación de PKCc. REα activado participaría en cascadas de señalización que conducen a la desinserción como por ejemplo las derivadas de la activación de PKA.