Examinando por Autor "Cricco, Julia Alejandra"
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Ítem Acceso Abierto A new model for Trypanosoma cruzi heme homeostasis depends on modulation of TcHTE protein expression(American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2020-07-23) Pagura, Lucas; Tevere, Evelyn; Merli, Marcelo Luciano; Cricco, Julia AlejandraÍtem Acceso Abierto Biosynthesis of heme O in intraerythrocytic stages of Plasmodium falciparum and potential inhibitors of this pathway(Springer Nature, 2019-12-17) Simão-Gurge, Raquel M.; Wunderlich, Gerhard; Cricco, Julia Alejandra; Galindo Cubillos, Eliana F.; Domenech-Carbó, Antonio; Cebrián-Torrejón, Gerardo; Almeida, Fernando G.; Cirulli, Brenda Analía; Katzin, Alejandro M.Ítem Acceso Abierto Caracterización de la proteína TcHTE y su relación con el transporte de hemo en Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-03-22) Pagura, Lucas; Cricco, Julia AlejandraTrypanosoma cruzi, el agente causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, carece de las enzimas de la vía de síntesis de hemo que está altamente conservada a los largo de la evolución, dando origen a la auxotrofía por esta molécula esencial para los organismos aeróbicos [Koreny, et al., 2010 - Panek y O'Brian, 2002]. Debido a esta deficiencia, T. cruzi debe incorporar este cofactor ya sea del hospedador mamífero o del insecto vector y al mismo tiempo controlar su distribución y concentración intracelular para evitar su toxicidad [Koreny, et al., 2010]. Debido a sus características hidrofóbicas, la carga del ión central y su tamaño, el hemo no podría atravesar libremente las membranas biológicas, por lo que se ha propuesto que deben existir transportadores proteicos dedicados a esta función [Cupello, et al., 2011 - Lara, et al., 2007] que le permitirían al parásito incorporar suficiente hemo para completar su cuota. Si bien se han descripto y caracterizado diversos mecanismos de incorporación de hemo en organismos procariotas [Anzaldi y Skaar, 2010], los mecanismos de transporte en organismos eucariotas no han sido caracterizados en su totalidad, y particularmente en tripanosomátidos, se desconocen cuáles son las proteínas involucradas y cómo funcionan. En este trabajo de tesis nos propusimos entonces, estudiar el proceso de importación del cofactor hemo en los diferentes estadios del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, analizando su regulación y procurando la identificación de proteínas que cumplan su función en alguna de estas etapas del transporte. Los resultados obtenidos han permitido profundizar el conocimiento general sobre el transporte de hemo en T. cruzi. Hemos avanzado en el estudio de la relación entre el hemo y el estadio de epimastigote analizando los efectos causados por los cambios en la disponibilidad de este cofactor sobre el parásito. Además, mediante la utilización de análogos fluorescentes de hemo (AHs) se logró determinar que el transporte de hemo ocurría solo en los estadios replicativos del parásito. Por otro lado, hemos identificado en el genoma de T. cruzi, una secuencia codificante para una proteína de la familia HRG (debido a su nombre en inglés Heme Responsive Genes), a la cual denominamos TcHTE. Mediante ensayos de complementación heteróloga comprobamos que esta proteína facilita el transporte de hemo en levaduras (de allí su nombre TcHTE por Heme Transport Enhancer) [Merli, et al., 2016]. Además, la expresión de la proteína recombinante como fusión a la proteína verde fluorescente en su extremo C-terminal (TcHTE-HIS-GFP) permitió identificar su localización en la membrana plasmática de las levaduras). En el parásito, la expresión de la proteína recombinante, nos permitió determinar que en epimastigotes y tripomastigotes, la proteína se localiza en la región del bolsillo flagelar [Merli, et al., 2016], mientras que en amastigotes la proteína recombinante se encontraría mayoritariamente en la región del bolsillo flagelar pero también pudo ser detectada en la membrana plasmática. Por otro lado, hemos comprobado que la expresión de la proteína recombinante en epimastigotes favorece la incorporación del cofactor hemo. Hemos diseñado y obtenido anticuerpos policlonales de conejo que reconocen específicamente a TcHTE, los cuales fueron utilizados en distintas técnicas (como Western Blot (WB), Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)) para analizar la acumulación de la proteína endógena en los diferentes estadios del ciclo celular del parásito, y su relación con la importación de hemo. Estos estudios fueron completados con el análisis de los niveles de transcripto de TcHTE, dando resultados concordantes. Tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto fueron más abundantes en los estadios replicativos del parásito siendo casi indetectables en el estadio de tripomastigote. Además, en epimastigotes determinamos que tanto la acumulación de la proteína como los niveles de transcripto, varían según la presencia de hemina en el medio de cultivo. A su vez, la utilización de los AHs nos permitió demostrar que el parásito regularía la expresión de la proteína TcHTE en función de la concentración intracelular de porfirinas (hemo y AHs). Mediante diversas técnicas de microscopía, y la utilización de la proteína recombinante TcHTE-HIS-GFP, fuimos capaces de comprobar que el extremo C-terminal se encuentra localizado del lado citosólico de la célula (tanto en el parásito, como en células HEK293-T), tal como había sido predicho para las proteínas de la familia HRG [Huynh, et al., 2012 - Rajagopal, et al., 2008 - Yuan, et al., 2012], siendo la primera vez que se comprueba experimentalmente. Además, los resultados que obtuvimos mediante TIRF-M indican que la proteína se encontraría formando multímeros (trímeros) en la superficie celular, lo que fortalece la hipótesis de que TcHTE forme parte del sistema responsable del transporte de hemo en T. cruzi. En función de los resultados obtenidos, podemos concluir que T. cruzi solo incorpora hemo en los estadios replicativos, mediante la expresión de un complejo proteico en el bolsillo flagelar, que involucraría la participación de trímeros de TcHTE. Si bien la regulación de la expresión del complejo es incierta, ésta respondería a la concentración y disponibilidad de hemo intracelular, permitiendo la incorporación del cofactor solo cuando es necesario, evitando así los efectos tóxicos de un exceso de hemo libre. Completar la elucidación de esta vía, identificando otras proteínas que participen en el proceso, y estableciendo los mecanismos de regulación, permitirían identificar nuevos blancos moleculares que puedan ser utilizados como estrategias para la inhibición de la proliferación de T. cruzi.Ítem Acceso Abierto Heme A synthesis and CcO activity are essential for Trypanosoma cruzi infectivity and replication(Portland Press, 2017-06-27) Merli, Marcelo Luciano; Cirulli, Brenda Analía; Menendez Bravo, Simón M. ; Cricco, Julia AlejandraÍtem Acceso Abierto Overexpression of bromodomain factor 3 in Trypanosoma cruzi (TcBDF3) affects differentiation of the parasite and protects it against bromodomain inhibitors(Wiley, 2016-06-06) Alonso, Victoria Lucía; Ritagliati, Carla; Cribb, Pamela; Cricco, Julia Alejandra; Serra, Esteban Carlos; Glaxo Smith Kline (GSK): provide I-BET151The bromodomain is the only protein domain known to bind acetylated lysine. In the last few years many bromodomain inhibitors have been developed in order to treat diseases such as cancer caused by aberrant acetylation of lysine residues. We have previously characterized Trypanosoma cruzi bromodomain factor 3 (TcBDF3), a bromodomain with an atypical localization that binds acetylated α-tubulin. In the present work we show that parasites overexpressing TcBDF3 exhibit altered differentiation patterns and are less susceptible to treatment with bromodomain inhibitors. We also demonstrate that recombinant TcBDF3 is able to bind to these inhibitors in vitro in a concentration-dependant manner. In parallel, the overexpression of a mutated version of TcBDF3 negatively affects growth of epimastigotes. Recent results, including the ones presented here, suggest that bromodomain inhibitors can be conceived as a new type of anti-parasitic drug against trypanosomiasis.Ítem Acceso Abierto Role of Heme and Heme-Proteins in Trypanosomatid essential metabolic pathways(Hindawi, 2011) Tripodi, Karina E. J.; Menendez Bravo, Simón M.; Cricco, Julia AlejandraÍtem Acceso Abierto Saccharomyces cerevisiae como herramienta para estudiar proteínas del metabolismo de hemo de Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-07-10) Cirulli, Brenda Analía; Cricco, Julia AlejandraEl eucariota unicelular Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas (Rassi y col., 2010). Tiene un ciclo de vida complejo que alterna entre dos hospedadores y al menos tres estadios diferentes. Sus necesidades nutricionales incluyen auxotrofía por el grupo hemo, dado que carece de las enzimas necesarias para su síntesis. T. cruzi debe incorporar el cofactor a partir del hospedador mamífero o invertebrado para suplir de hemo a las numerosas hemoproteínas que posee (incluidas las de los complejos de cadena respiratoria mitocondrial) (Korený y col., 2010; Tripodi y col., 2011). La posterior conversión del hemo incorporado a la forma hemo A, cofactor del complejo IV o CcO (citocromo c oxidasa), ocurre a través de dos reacciones enzimáticas secuenciales mediadas por una Hemo O Sintasa (HOS o Cox10) y una Hemo A Sintasa (HAS o Cox15). Ambas enzimas se localizan en la membrana interna mitocondrial en eucariotas y están altamente conservadas (Brown y col., 2002; Zee y Glerum, 2006). En nuestro laboratorio se identificaron las secuencias codificantes para las enzimas del tipo HOS y HAS en el genoma T. cruzi, las cuales se denominaron TcCOX10 y TcCOX15, respectivamente (Buchensky y col., 2010). Respecto al transporte de hemo en eucariotas, éste no está muy bien caracterizado y, particularmente en tripanosomátidos, se desconocen cuáles son las proteínas involucradas y cómo operan aunque en los últimos años se han realizado algunos hallazgos (Horáková y col., 2015; Martínez-García y col., 2016; Merli y Pagura y col., 2016). Por otro lado, Saccharomyces cerevisiae es un organismo eucariota unicelular de vida libre, no patógeno, y es ampliamente utilizado como modelo de estudio biológico de otros eucariotas debido a estas y otras numerosas características que resultan ventajosas a la hora de su manipulación (Karathia y col., 2011). Además es capaz de sintetizar hemo, utilizando una ruta altamente conservada a través de la evolución que culmina en la matriz mitocondrial. También es capaz de sintetizar hemo A mediante las enzimas ScCox10 y ScCox15 mitocondriales. S. cerevisiae posee 3 transportadores de tipo ABC mitocondriales, pero ninguno de ellos es específico para hemo; se denominan Atm1, Mdl1 y Mdl2 (Jungwirth y Kuchler, 2006). En este trabajo de Tesis nos proponemos estudiar proteínas con posible rol en el metabolismo y transporte de hemo mitocondrial de T. cruzi utilizando a S. cerevisiae como sistema modelo. Es así que analizamos la posible función de la proteína codificada por el gen de T. cruzi que denominamos mtTcABCB, homólogo a la proteína de mamíferos ABCB6 involucrada en el transporte mitocondrial de porfirinas. Además, profundizamos el estudio del rol funcional de TcCox10, una de las enzimas de la biosíntesis de hemo A. Respecto al transporte mitocondrial de hemo, se evaluó la capacidad de mtTcAbcB de transportar hemo en mitocondria de S. cerevisiae. Los resultados obtenidos no nos permitieron elucidar la función de mtTcAbcB en mitocondria. Ensayos adicionales nos permitieron descartar su función de transporte de porfirinas en membrana plasmática de S. cerevisiae. La proteína recombinante mtTcAbcB.His-GFP se expresa en levaduras dado que se ha visualizado su fluorescencia intrínseca en el interior de las células. Si bien no podemos inferir sobre la función a la proteína de T. cruzi mtTcAbcB en S. cerevisiae, los resultados obtenidos tampoco nos permiten descartar su probable función como transportador de hemo mitocondrial en T. cruzi. En el análisis de estos resultados se debe considerar que, al ser S. cerevisiae capaz de sintetizar hemo, posiblemente no sea este el modelo adecuado para estudiar el transporte de hemo al interior mitocondrial. Para completar y profundizar el estudio de la enzima HOS de T. cruzi (TcCox10) se construyó una versión recombinante con fusión a GFP, TcCox10.His-GFP. La misma se visualizó intracelularmente en S. cerevisiae en lo que parecen ser vesículas y al menos parte se detectó en mitocondrias. La funcionalidad de TcCox10.His-GFP se demostró mediante ensayos de complementación en placa de células de S. cerevisiae cox10Δ y, de forma complementaria, por medidas de consumo de O2 de las mismas células cox10Δ transformantes. Algunos de los resultados obtenidos indican que la fusión a GFP altera de alguna manera la eficiencia de TcCox10 como HOS y permiten postular un posible modelo de ruta del hemo en S. cerevisiae y en T. cruzi. Un análisis predictivo de los segmentos transmembrana y orientación de cada proteína utilizando distintos algoritmos arroja resultados que también apoyarían este modelo. La expresión de TcCox10.His-GFP en epimastigotes de T. cruzi confirmó la localización mitocondrial de la proteína de fusión. En función de los resultados obtenidos en nuestro laboratorio tanto con TcCox10 como con TcCox15 (Tesis doctoral del Dr. Marcelo L. Merli) así como los resultados obtenidos en otros grupos de investigación con los transportadores de Leishamania y de T. brucei, consideramos que S. cerevisiae es un modelo válido para el estudio funcional de proteínas de otros organismos eucariotas cuyo ortólogo esté presente también en la levadura, mientras que para el estudio de proteínas con funciones no identificadas en levadura se deben tener en cuenta las limitaciones del modelo.Ítem Acceso Abierto Targeting L-Proline uptake as new strategy for anti-chagas drug development(Frontiers Media, 2020-08-25) Fargnoli, Lucía; Panozzo Zénere, Esteban Andrés; Pagura, Lucas; Barisón, María Julia; Cricco, Julia Alejandra; Silber, Ariel M.; Labadie, Guillermo RobertoÍtem Acceso Abierto TcHRG plays a central role in orchestrating heme uptake in Trypanosoma cruzi epimastigotes(Wiley, 2023-04-05) Tevere, Evelyn; Di Capua, Cecilia Beatriz; Chasen, Nathan Michael; Etheridge, Ronald Drew; Cricco, Julia Alejandra; https://orcid.org/0000-0001-9215-5015; https://orcid.org/0000-0002-8982-3489; https://orcid.org/0000-0002-9144-287X; https://orcid.org/0000-0002-8993-3880Trypanosoma cruzi, a heme auxotrophic parasite, can control intracellular heme content by modulating TcHRG expression when a free heme source is added to axenic culture. Herein, we explore the role of TcHRG protein in regulating the uptake of heme derived from hemoglobin in epimastigotes. It was found that the parasite’s endogenous TcHRG (protein and mRNA) responds similarly to bound (hemoglobin) and free (hemin) heme. Additionally, the overexpression of TcHRG leads to an increase in intracellular heme content. The localization of TcHRG is also not affected in parasites supplemented with hemoglobin as the sole heme source. Endocytic null epimastigotes do not show a significant difference in growth profile, intracellular heme content and TcHRG protein accumulation compared to WT when feeding with hemoglobin or hemin as a source of heme. These results suggest that the uptake of hemoglobin-derived heme likely occurs through extracellular proteolysis of hemoglobin via the flagellar pocket, and this process is governed by TcHRG. In sum, T. cruzi epimastigotes controls heme homeostasis by modulating TcHRG expression independently of the source of available heme.Ítem Acceso Abierto The heme uptake process in Trypanosoma cruzi epimastigotes is inhibited by heme analogues and by inhibitors of ABC transporters(Elsevier, 2011) Cupello Peixoto, Mauricio; Fernandes de Souza, Cíntia; Buchensky, Celeste; Rocha Corrêa Soares, Juliana Baptista; Travassos Laranja, Gustavo Augusto; Garcia Pinto Coelho, Marsen; Cricco, Julia Alejandra; Paes, Marcia CristinaÍtem Acceso Abierto The Trypanosoma cruzi Protein TcHTE Is Critical for Heme Uptake(Public Library of Science PLOS, 2016-01) Merli, Marcelo Luciano; Pagura, Lucas; Hernández, Josefina; Barisón, María Julia; Pral, Elizabeth M. F.; Silber, Ariel M.; Cricco, Julia AlejandraÍtem Acceso Abierto The Trypanosoma cruzi proteins TcCox10 and TcCox15 catalyze the formation of heme A in the yeast Saccharomyces cerevisiae(Oxford University Press, 2010-11) Buchensky, Celeste; Almirón, Paula; Suarez Mantilla, Brian; Silber, Ariel M.; Cricco, Julia AlejandraÍtem Embargo Transporte de hemo y biosíntesis de hemo A en Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-12-19) Merli, Marcelo Luciano; Cricco, Julia AlejandraEl hemo es una molécula esencial para la mayoría de los organismos aeróbicos (Koreny et al., 2013). Su biosíntesis consta de 8 pasos enzimáticos y está conservada a los largo de la evolución (Korený et al., 2010; Panek y O'Brian, 2002). Trypanosoma cruzi, el protista causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, no es capaz de sintetizar el hemo por lo que debe incorporarlo ya sea del hospedador mamífero o del insecto vector y al mismo tiempo controlar los niveles intracelulares para evitar su toxicidad (Korený et al., 2010). El hemo no puede atravesar libremente las membranas biológicas, por ello está aceptado que existen transportadores proteicos dedicados a esta función (Cupello et al., 2011; Lara et al., 2007) y de esta manera pueda ser distribuido entre los diferentes compartimentos subcelulares incluida la mitocondria. En ella se incorpora a diferentes hemoproteínas, siendo una de las más relevantes la citocromo c oxidasa (CcO) del tipo aa3 de la cadena transportadora de electrones (complejo IV) (Tripodi et al., 2011). En este trabajo de tesis nos proponemos entonces estudiar aspectos generales del transporte y del metabolismo de hemo en epimastigotes de T. cruzi: requerimiento del hemo en el crecimiento, efecto tóxico y posibles vías de degradación, y mediante el uso de distintos análogos fluorescentes de hemo (AHs) avanzar en la caracterización del transporte de hemo. Los AHs poseen estructuras similares al hemo pero sus propiedades fluorescentes permiten el estudio del transporte mediante técnicas espectroscópicas y de microscopía de fluorescencia. Por otro lado, se estudió el rol de TcCox15, la enzima hemo A sintasa (HAS) de T. cruzi responsable de la segunda reacción de la conversión del hemo en hemo A: cofactor únicamente de la CcO del tipo aa3. Para ello se obtuvieron anticuerpos específicos contra la proteína que permitieron estudiar los niveles de TcCox15 en los distintos estadios y su localización, y se generaron mutantes puntuales de TcCox15 cuya expresión en los distintos estadios del parásito permitieron evaluar el rol de esta enzima. Nuestros resultados nos permiten proponer que los epimastigotes de T. cruzi captan más hemo del mínimo necesario para cumplir con sus funciones celulares y pueden almacenarlo para usos posteriores aunque estas reservas son limitadas; tienen capacidad de regular la cantidad de hemo intracelular y ante una disminución de este, incrementan su capacidad de tomarlo del medio adaptándose a variaciones en la disponibilidad del hemo del entorno. Por otro lado se corroboró que no tienen actividad ferroquelatasa (FeCH), la última enzima de la vía de síntesis de hemo. Todos los AHs ensayados interfirieron con el transporte de hemo por parte del parásito, aunque solo algunos fueron transportados y solo los que fueron incorporados lograron ejercer un efecto tóxico. Esta selectividad en el transporte no fue igual en todas las cepas estudiadas, lo que apoyaría la hipótesis de un sistema de transporte de hemo específico mediado por un complejo proteico especializado. Con respecto a la síntesis de hemo A, se identificaron en el genoma de T. cruzi por búsqueda bioinformática genes que podrían participar junto a TcCox15 en la síntesis de hemo A y en el ensamblado del CcO: una posible ferredoxina Yah1, una posible ferredoxina reductasa Arh1 y una secuencia con homología a Shy1. La presencia de estas proteínas (probables) apoyarían la hipótesis de que la síntesis de hemo A en T. cruzi, la reacción catalizada por la enzima HAS, procedería de manera similar a lo que sucede en otros organismos eucariotas como S. cerevisiae y justifica la actividad observada por TcCox15 cuando se expresó en células de levaduras cox15Δ (Buchensky et al., 2010 y este trabajo de tesis). En cuanto a TcCox15, se determinó que su localización es mitocondrial como en las demás eucariotas y sus niveles de acumulación fueron mayores en los estadios replicativos, epimastigote y amastigote (aunque es mayor en epimastigote), en comparación con el estadio infectivo de tripomastigote. En ensayos de complementación en levadura cox15Δ se determinó que la fusión de GFP al C-terminal de TcCox15 afecta la función de la enzima y que incluso se afectaría el funcionamiento de la Cox15 endógena de levaduras cuando TcCox15.His.GFP se expresó en un entorno salvaje. Por último, los residuos H129, H206 y H307 de TcCox15 conservados en la familia de enzimas con actividad HAS, resultaron esenciales para la actividad de esta enzima. El reemplazo de los residuos de histidinas por alaninas generó mutantes no funcionales y el análisis de la sobreexpresión de estas mutantes en los distintos estadios nos permitieron determinar que la síntesis de hemo A es esencial para el crecimiento de los epimastigotes y para la actividad de la CcO, demostrando además que esta sería la oxidasa terminal principal del parásito. Además afectar la ruta de síntesis de hemo A causó un efecto negativo sobre la infección de tripomastigotes (en las primeras etapas de la infección) y sobre la replicación intracelular de amastigotes.