Examinando por Autor "Comba, Santiago"
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Ítem Acceso Abierto Biochemical characterization of the minimal domains of an iterative eukaryotic polyketide synthase(Wiley, 2018-10-25) Sabatini, Martín; Comba, Santiago; Altabe, Silvia Graciela; Recio Balsells, Alejandro Iván; Labadie, Guillermo Roberto; Takano, Eriko; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaÍtem Acceso Abierto Identification and physiological characterization of phosphatidic acid phosphatase enzymes involved in triacylglycerol biosynthesis in Streptomyces coelicolor(BMC, 2013-01-29) Comba, Santiago; Menendez Bravo, Simón M.; Arabolaza, Ana Lorena; Gramajo, Hugo CesarBackground: Phosphatidic acid phosphatase (PAP, EC 3.1.3.4) catalyzes the dephosphorylation of phosphatidate yielding diacylglycerol (DAG), the lipid precursor for triacylglycerol (TAG) biosynthesis. Despite the importance of PAP activity in TAG producing bacteria, studies to establish its role in lipid metabolism have been so far restricted only to eukaryotes. Considering the increasing interest of bacterial TAG as a potential source of raw material for biofuel production, we have focused our studies on the identification and physiological characterization of the putative PAP present in the TAG producing bacterium Streptomyces coelicolor. Results: We have identified two S. coelicolor genes, named lppα (SCO1102) and lppβ (SCO1753), encoding for functional PAP proteins. Both enzymes mediate, at least in part, the formation of DAG for neutral lipid biosynthesis. Heterologous expression of lppα and lppβ genes in E. coli resulted in enhanced PAP activity in the membrane fractions of the recombinant strains and concomitantly in higher levels of DAG. In addition, the expression of these genes in yeast complemented the temperature-sensitive growth phenotype of the PAP deficient strain GHY58 (dpp1lpp1pah1). In S. coelicolor, disruption of either lppα or lppβ had no effect on TAG accumulation; however, the simultaneous mutation of both genes provoked a drastic reduction in de novo TAG biosynthesis as well as in total TAG content. Consistently, overexpression of Lppα and Lppβ in the wild type strain of S. coelicolor led to a significant increase in TAG production. Conclusions: The present study describes the identification of PAP enzymes in bacteria and provides further insights on the genetic basis for prokaryotic oiliness. Furthermore, this finding completes the whole set of enzymes required for de novo TAG biosynthesis pathway in S. coelicolor. Remarkably, the overexpression of these PAPs in Streptomyces bacteria contributes to a higher productivity of this single cell oil. Altogether, these results provide new elements and tools for future cell engineering for next-generation biofuels production.Ítem Acceso Abierto Regulación del metabolismo lipídico en Streptomyces coelicolor(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2015-03-20) Comba, Santiago; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaStreptomyces es un género bacteriano caracterizado por poseer un complejo ciclo de vida que involucra varios pasos de diferenciación fisiológica y morfológica. Durante su desarrollo, las bacterias de este género suelen producir una amplia gama de metabolitos con actividad biológica, que han sido tradicionalmente utilizados como antibióticos, antiparasitarios, antifúngicos, anticancerígenos, entre otros. Sin embargo, los Streptomyces son capaces también de sintetizar y acumular triglicéridos (TAG) como reserva de energía y carbono. Esta característica, si bien es inusual en bacterias, es compartida con otros géneros del orden de los Actinomicetales como Rhodoccocus, Nocardia y Mycobacterium. A pesar de su diversificado metabolismo lipídico, los estudios en el género Streptomyces se han concentrado generalmente en el área de la producción de metabolitos secundarios, y muy poco se conoce acerca de cómo este organismo sintetiza sus ácidos grasos y regula su flujo hacia fosfolípidos o TAG. Además, en S. coelicolor la síntesis de ácidos grasos y del metabolito secundario actinorrodina comparten un precursor clave, el malonil-CoA, lo que plantea un complejo escenario regulatorio para la síntesis de estos compuestos carbonados en este microorganismo. Así, como objetivo general de este trabajo de tesis nos propusimos identificar y caracterizar los mecanismos genéticos y bioquímicos que regulan la síntesis de ácidos grasos y lípidos de reserva en Streptomyces coelicolor. Para ello, en una primera etapa nos centramos en la caracterización de un regulador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos en esta bacteria, FasR, con el fin de develar su rol fisiológico y entender de qué manera lleva a cabo su función regulatoria. Demostramos, mediante experimentos genéticos y bioquímicos, que FasR es un activador transcripcional del operón fab (fabD-fabH-acpP-fabF), el cual codifica para las proteínas esenciales del sistema de sintasa de ácidos grasos de tipo II de este organismo. FasR lleva a cabo su función uniéndose directamente a la región corriente arriba del operón fab, y su actividad estaría modulada por algún metabolito relacionado con el metabolismo de lípidos. A continuación nos planteamos identificar el paso enzimático que genera el diacilglicerol (DAG), un sustrato clave para la síntesis de TAG. A pesar del rol que juegan estas moléculas en las diferentes especies como reserva de energía y carbono, la ruta de abastecimiento de DAG para su síntesis es completamente desconocida en bacterias. En este apartado trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas fosfatidato fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían las responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el DAG necesario para la síntesis de TAG. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar tres probables proteínas con actividad PAP. El posterior estudio de las mismas reveló que sólo dos de ellas, Lppα y Lppβ, eran capaces de defosforilar fosfatidato in vitro y tenían además un rol en el metabolismo lipídico de S. coelicolor. Una cepa mutante en ambos genes presentó niveles reducidos de TAG a tiempos cortos de crecimiento, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a tiempos mayores. Estas evidencias indican que si bien tanto Lppα como Lppβ estarían proveyendo DAG para la síntesis de TAG en S. coelicolor, existen en este organismo rutas alternativas de generación de DAG que prevalecen a tiempos largos de cultivo. Por último, con la información obtenida a partir de estos estudios básicos se reconstituyó la vía de síntesis de TAG en la bacteria no oleaginosa E. coli como prueba de concepto acerca de la funcionalidad de los genes caracterizados en la vía de síntesis de TAG en S. coelicolor. Para ello se utilizó como hospedador una cepa de E. coli ΔdgkA, que posee una deleción en el gen que codifica para una DAG quinasa capaz de reciclar el DAG hacia la síntesis de fosfolípidos. En este contexto se expresaron en forma heteróloga las enzimas fosfatidato fosfatasa Lppβ y DAG aciltransferasa Sco0958, que catalizan los dos últimos pasos de la síntesis de TAG. Si bien la sola expresión de Sco0958 demostró ser suficiente para la síntesis de TAG en este contexto genético, la expresión adicional de la fosfatasa Lppβ tuvo un efecto positivo en el contenido de TAG, confirmando su capacidad de generar el sustrato DAG limitante para la síntesis de TAG. Luego de una optimización de la cepa de E. coli productora de TAG, y de su cultivo en sistemas de alta densidad, fuimos capaces de obtener una producción de 722,1 mg TAG/L, lo que constituye el mayor título de TAG reportado para E. coli recombinantes en la literatura. En conjunto, estos resultados muestran cómo las evidencias que surgen a partir de estudios básicos pueden volcarse en el campo aplicado para resolver una necesidad particular. Sin embargo, a pesar de lograr el mayor título de TAG reportado hasta el momento para E. coli, es necesario aún incrementar la productividad volumétrica de TAG en este sistema para lograr el establecimiento de este huésped heterólogo como futura plataforma de biosíntesis de lípidos neutros aptos para la producción de, por ejemplo, biocombustibles.