Examinando por Autor "Checa, Susana Karina"
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Ítem Embargo Caracterización de sistemas de resistencia a mercurio de un plásmido de multi-resistencia de Salmonella Typhimuriums(2024) Trumper, Martín; Checa, Susana KarinaEl mercurio (Hg) es un metal tóxico que afecta gravemente la salud humana y la diversidad de la biota. Las bacterias han desarrollado mecanismos para detectar y resistir este contaminante, ya sea en su forma ionizada (Hg²⁺) o cuando está unido covalentemente a compuestos orgánicos (organomercuriales). La desintoxicación requiere la entrada de estas especies tóxicas al citoplasma a través de transportadores y, si es necesario, la liberación de Hg²⁺ mediante la acción de una liasa de organomercuriales. Luego, el Hg²⁺ es reducido a Hg⁰, que es menos dañino, se volatiliza y permite su eliminación. Los determinantes de resistencia generalmente están codificados en un único operón asociado con la proteína sensora/reguladora MerR, que detecta el ion en el citoplasma y activa su transcripción. Estos loci suelen estar codificados en plásmidos que contienen, además, múltiples determinantes de resistencia a otros metales (o metaloides) y antibióticos, así como elementos genéticos móviles. Dado el problema de la diseminación y la co-selección de resistencia a los antimicrobianos, se planteó la caracterización de uno de estos plásmidos presente en diferentes aislados clínicos de Salmonella Typhimurium. Este plásmido contiene no uno, sino dos loci de resistencia a Hg, mer1 y mer2, y las cepas que los portan son al menos 16 veces más resistentes a Hg²⁺ que la cepa silvestre. Para evaluar la contribución de cada locus a la tolerancia al Hg, mer1 y mer2 fueron clonados en plásmidos compatibles e introducidos en cepas de Escherichia coli y en Salmonella Typhimurium. La presencia de mer1 o mer2 aumentó la resistencia al HgCl₂, aunque mer1 fue el principal contribuyente. Solo mer2, que codifica la liasa organomercurial MerB, proporcionó resistencia a la forma orgánica de este contaminante. Llamativamente, en las condiciones ensayadas no se logró evidenciar un efecto aditivo de estos loci sobre la tolerancia a compuestos del mercurio, observando en todos los casos niveles de resistencia similares a los de la cepa que porta el loci dominante y niveles de resistencia significativamente menores a los observados para el aislamiento clínico 33676. A la luz de estos resultados, se investigó la posibilidad de co-regulación entre estos loci. Para ello, se clonó en diferentes plásmidos las proteínas reguladoras MerR, MerR1 y MerR2, y la región promotora de cada operón (PmerT1 y PmerT2) aguas arriba del gen reportero lacZ. Usando ensayos de actividad β-galactosidasa, se analizó la capacidad de cada proteína reguladora para modular la expresión de su operón asociado y del operón asociado al otro regulador. Los resultados obtenidos indican que tanto MerR1 como MerR2 controlan eficientemente la transcripción de ambos operones en respuesta a Hg2+, aunque se observó una mayor capacidad de activación para su operón asociado. En ausencia del inductor, ambos factores regulatorios fueron igualmente eficientes para reprimir la transcripción de estos promotores. Se observaron también diferencias en la expresión basal de los promotores ensayados. Estos hallazgos contribuyen a la caracterización de determinantes de resistencia a mercurio de amplio espectro presentes en plásmidos de multi-resistencia de bacterias patógenas. Por esto, tienen implicancia para la salud y la biotecnología, ya que estos loci de resistencia podrían servir de base para el desarrollo futuro de herramientas para el cuidado ambiental.Ítem Acceso Abierto Caracterización funcional de sistemas de tolerancia y resistencia a metales monovalentes en Salmonella enterica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2014-03-26) Cerminati, Sebastián; Checa, Susana KarinaLos elementos metálicos están involucrados en todas las fases de la existencia microbiana y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. Por ello, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estas especies y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener la homeostasis y prevenir el estrés. Salmonella entérica serov. typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal, como CueR y GolS, que reconocen iones de metales monovalentes. Además, la bacteria dispone de sistemas no específicos que son importantes moduladores de las respuesta global al estrés celular producido por metales, como el sistema de dos componente CpxAR. En este trabajo, utilizamos al sistema gol de resistencia a Au controlado por GolS como plataforma en el desarrollo del primer biosensor bacteriano fluorescente específico para este metal, utilizando como bacteria residente del sistema de detección tanto Salmonella, como cepas no patógenas de Escherichia coli. En condiciones de laboratorio, estos biosensores demostraron ser eficaces para detectar Au específicamente en un rango de concentraciones adecuado para la detección del metal en muestras del ambiente. Este desarrollo tecnológico y variantes no selectivas del sensor GolS previamente desarrolladas en el laboratorio fueron utilizados para la generación de nuevos biosensores bacterianos para la detección de una amplia variedad de metales tóxicos, incluyendo Au, Cu, Ag, Hg, Cd y Pb, metales que son altamente nocivos para el ecosistema. Estos dispositivos, ensayados en condiciones de laboratorio, sirven de prueba de concepto para la utilización de los mismos en monitoreo ambiental de muestras acuosas. Por otro lado, y como parte de la caracterización del sistema de eflujo GesABC, perteneciente al regulón gol de resistencia a Au de S. typhimurium, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático como co-regulador y evidenciamos la relevancia de esta regulación adicional para la sobrevida en condiciones de estrés.Ítem Acceso Abierto Chaperones moleculares : su rol en el proceso de plegamiento y ensamble intracelular de proteínas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1999-04-08) Checa, Susana Karina; Viale, Alejandro M.El plegamiento de las proteínas a su conformación nativa constituye una de las bases para el correcto funcionamiento celular. La eficiencia del proceso es asegurada in vivo gracias a la participación entre otros, de sistemas especializados de proteínas denominados chaperones moleculares. Estos asistentes de plegado interaccionan no covalentemente con polipéptidos total o parcialmente desplegados favoreciendo el plegado productivo por sobre las reacciones no productivas que conducen a la agregación en condiciones fisiológicas y de estrés. Numerosas evidencias experimentales indican que distintos chaperones pueden cooperar en las células. Se ha propuesto que los sistemas de chaperones Hsp70/DnaK y Hsp60/GroE actúan secuencialmente asistiendo el plegamiento de proteínas recién sintetizadas o desnaturalizadas y el importe de éstas a organelas. Sin embargo, la transferencia secuencial parece no ocurrir en todos los casos y por ello se ha propuesto la existencia de redes flexibles y funcionales …Ítem Embargo Diseño de biosensores selectivos para reportar contaminación por metales pesados tóxicos(2021) Mendoza, Julián I.; Checa, Susana KarinaLos metales pesados se diseminan en la biosfera como consecuencia de procesos geoquímicos, pero además debido a la actividad antropogénica. Dada su persistencia intrínseca y su alta reactividad química, estas especies contribuyen fuertemente a la contaminación del ambiente afectando severamente a la biota y en consecuencia al hombre. Entre ellos, plomo (Pb), mercurio (Hg) y cadmio (Cd) se encuentran entre los 10 tóxicos más peligrosos según la Organización Mundial de la Salud. La detección de metales se lleva a cabo usualmente utilizando métodos analíticos aunque en los últimos años se ha desarrollado la tecnología de biosensores, en concreto, biosensores bacterianos, microorganismos que han sido modificados genéticamente para acoplar la detección del metal a la producción de una señal fácilmente cuantificable. Esta tecnología emerge como una alternativa más simple y económica, pero además por reportar únicamente la fracción del metal biodisponible, presenta una ventaja adicional para su uso en monitoreo ambiental. Sin embargo, la aplicación extensiva de estos dispositivos para identificar y cuantificar el agente responsable de la contaminación se ha visto limitada por la baja sensibilidad que presentan. En el laboratorio donde se realizó esta Tesis Doctoral, previamente se identificó y caracterizó en S. Typhimurium a GolS, el primer regulador transcripcional de la familia MerR capaz de reconocer Au1+ y de activar su propia síntesis, y la de determinantes de resistencia a este metal tóxico. Sobre la base de esta vía regulatoria se generó un biosensor que detecta específicamente iones de Au. Reemplazando la Ser en posición 77 por Cys (residuo conservado en metalo-reguladores de metales divalentes) en esta proteína, se generó la variante GolS77; la cual fue utilizada para generar un biosensor que detecta un amplio espectro de metales pesados de manera no selectiva. En este trabajo se propuso obtener variantes de GolS77 con capacidad para detectar Hg o Pb/Cd mediante el reemplazo del rulo de unión a metal por la misma región de sensores de Hg2+ MerR o de Zn2+/Pb2+/Cd2+ ZntR. Como resultado más relevante, se obtuvo la variante GolS77-LRT, y un biosensor derivado de esta que detecta especificamente Hg biodisponible en muestras de agua, y se diseñó un protocolo de medición simple que permitió cuantificar este metal en muestras de agua contaminada. Además, se generaron variantes de los sensores no específicos CueR77 y ZntR con diferentes capacidades de detección, entre ellas la variante ZntR-LRT que responde a Cd2+, que nos permitirán obtener información acerca de la interacción de estos sensores sintéticos con distintos metales.Ítem Acceso Abierto Evolution of Copper Homeostasis and Virulence in Salmonella(Frontiers Media, 2022-03-16) Méndez, Andrea A. E.; Mendoza, Julián I.; Echarren, María Laura; Terán, Ignacio; Checa, Susana Karina; Soncini, Fernando C.Ítem Acceso Abierto Integration of BrfS into the biofilm-controlling cascade promotes sessile Salmonella growth at low temperatures(Elsevier, 2025-01-21) Tulin, Gonzalo; Méndez, Andrea A. E.; Figueroa, Nicolás; Smith, Carol; Folmer, María P.; Serra, Diego Omar; Wade, Joseph T.; Checa, Susana Karina; Soncini, Fernando C.Biofilm formation is stimulated by different stress-related physiological and environmental conditions. In Salmonella and Escherichia coli, curli fibers and phosphoethanolamine-cellulose are the major extracellular components of biofilms. The production of both is under the control of CsgD, a transcriptional regulator whose expression is modulated by a number of factors responding to different signals. The atypical MerR-like regulator MlrA is key in the activation of csgD transcription in both Salmonella and E. coli. Recently, MlrB, a SPI-2-encoded MlrA-like regulator that counteracts MlrA by repressing csgD transcription and biofilm formation inside mac rophages was identified. Here, we characterize STM1266, a Salmonella-specific MlrA-like regulator, recently renamed BrfS. In contrast to mlrA, brfS transcription increases in minimal growth media and at 20 ◦C, a temperature not commonly tested in laboratories. Under these conditions, as well as in salt-limited rich medium, deletion or overexpression of brfS affects extracellular matrix production. Using transcriptomics, we uncovered genes under BrfS control relevant for biofilm formation such as csgB and bapA. Transcriptional analysis of these genes in mutants lacking brfS, csgD or both, indicates that BrfS controls curli biosynthesis both in a CsgDdependent and independent manner. By contrast, at low temperatures, bapA transcription depends only on BrfS, and neither deletion of csgD nor of mlrA modify its expression. Based on these results, we propose that BrfS contributes to Salmonella persistence in the environment, where the pathogen encounters low temperatures and nutrient limitation.Ítem Acceso Abierto Scs system links copper and redox homeostasis in bacterial pathogens(Elsevier, 2021-02-01) Méndez, Andrea A. E.; Argüello, José M.; Soncini, Fernando C.; Checa, Susana KarinaThe bacterial envelope is an essential compartment involved in metabolism and metabolites transport, virulence, and stress defense. Its roles become more evident when homeostasis is challenged during host–pathogen interactions. In particular, the presence of free radical groups and excess copper in the periplasm causes noxious reactions, such as sulfhydryl group oxidation leading to enzymatic inactivation and protein denaturation. In response to this, canonical and accessory oxidoreductase systems are induced, performing quality control of thiol groups, and therefore contributing to restoring homeostasis and preserving survival under these conditions. Here, we examine recent advances in the characterization of the Dsblike, Salmonella-specific Scs system. This system includes the ScsC/ScsB pair of Cu+-binding proteins with thioloxidoreductase activity, an alternative ScsB-partner, the membrane-linked ScsD, and a likely associated protein, ScsA, with a role in peroxide resistance. We discuss the acquisition of the scsABCD locus and its integration into a global regulatory pathway directing envelope response to Cu stress during the evolution of pathogens that also harbor the canonical Dsb systems. The evidence suggests that the canonical Dsb systems cannot satisfy the extra demands that the host-pathogen interface imposes to preserve functional thiol groups. This resulted in the acquisition of the Scs system by Salmonella. We propose that the ScsABCD complex evolved to connect Cu and redox stress responses in this pathogen as well as in other bacterial pathogens.Ítem Acceso Abierto The protein scaffold calibrates metal specificity and activation in MerR sensors(Wiley Open Access, 2022) Mendoza, Julián I.; Lescano, Julián; Soncini, Fernando C.; Checa, Susana Karina; https://orcid.org/0000-0002-1975-3606; https://orcid.org/0000-0002-8925-7763; https://orcid.org/0000-0003-1629-2848MerR metalloregulators are the central components of many biosensor plat-forms designed to report metal contamination. However, most MerR proteins are non-specific. This makes it difficult to apply these biosensors in the analy-sis of real environmental samples. On-demand implementation of molecular engineering to modify the MerR metal preferences is innovative, although it does not always yield the expected results. As the metal binding loop region (MBL) of these sensors has been proposed to be the major modulator of their specificity, we surgically switched this region for that of well-characterized specific and non-specific homologues. We found that identical modifications in different MerR proteins result in synthetic sensors displaying particular metal-detection patterns that cannot be predicted from the nature of the as-sembled modules. For instance, the MBL from a native Hg(II) sensor provided non-specificity or specificity toward Hg(II) or Cd(II) depending on the MerR scaffold into which it was integrated. These and other evidences reveal that residues outside the MBL are required to modulate ion recognition and trans-duce the input signal to the target promoter. Revealing their identity and their interactions with other residues is a critical step toward the design of more efficient biosensor devices for environmental metal monitoring.