Examinando por Autor "Buffone, Mariano Gabriel"

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    ÍtemEmbargo
    Cascadas de señalización bifásicas que modulan la adquisición de la capacidad fecundante en mamíferos
    (2022) Baró Graf, Carolina; Krapf, Darío; Buffone, Mariano Gabriel
    Los espermatozoides de mamíferos recién eyaculados no tienen la capacidad de fecundar al óvulo. Primero deben atravesar una serie de eventos fisiológicos conocidos como “capacitación”. Este proceso resulta en la adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a un inductor como la progesterona (Pg), y un cambio en el patrón de motilidad denominado hiperactivación. A nivel molecular, durante la capacitación se dan numerosos eventos entre los cuales se encuentran la activación rápida de la proteína quinasa A (PKA) y la hiperpolarización del potencial de membrana (Em), en donde el interior celular se vuelve más negativo, comparado con el exterior. En humanos, trabajos previos han reportado la existencia de la hiperpolarización del Em asociada a la capacitación, pero sólo en forma cualitativa mediante citometría de flujo o el uso de electrofisiología. Sin embargo, en dichos trabajos no se determinó el cambio en el Em a nivel cuantitativo durante el proceso de capacitación. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo nos propusimos optimizar un método para evaluar este parámetro, con el objetivo de estudiar su rol en la capacitación del espermatozoide. Utilizamos un ensayo de fluorimetría poblacional para medir el Em que permite la obtención de un valor absoluto ya que se emplea una curva de calibración interna por condición. Habiendo estandarizado la medición del Em, se evidenció una hiperpolarización de la membrana plasmática significativa en condiciones capacitantes entre muestras normospérmicas; no siendo el caso para muestras no normospérmicas. Esto sugiere que la hiperpolarización se relaciona estrechamente con el estado fisiológico del espermatozoide. En cuanto al rol biológico de la hiperpolarización, se encontró una correlación entre los valores de Em de espermatozoides capacitados y el porcentaje de RA inducida con Pg, donde muestras más hiperpolarizadas tuvieron mayores porcentajes de RA inducida. Sumado a esto, observamos una clara tendencia a la hiperactivación entre aquellas muestras hiperpolarizadas. Estos datos implican que la hiperpolarización de la membrana plasmática juega un papel importante en el proceso de capacitación. Para determinar si la hiperpolarización está asociada a la capacidad fecundante de espermatozoides humanos, medimos el Em de muestras de pacientes destinadas a tratamientos de fecundación in vitro (FIV). Demostramos que muestras espermáticas con porcentajes de FIV exitosos exhiben hiperpolarización del Em con la capacitación, no siendo el caso para aquellas muestras con menores tasas de FIV. Además, se encontró una correlación significativa entre los valores de Em de muestras capacitadas y las tasas de FIV. Mediante un análisis de curva ROC concluimos que el Em de muestras capacitadas es un buen parámetro para discriminar entre tasas de FIV exitosas y no exitosas. Finalmente, realizamos el seguimiento del Em en un grupo de 10 donantes durante 5 semanas. Llegamos a la conclusión de que dicho parámetro es homogéneo y que podría ser incluido en el análisis previo que se realizan los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida. Para terminar, nos propusimos evaluar los mecanismos moleculares por los cuales el espermatozoide humano alcanza la hiperpolarización asociada a la capacitación. Teniendo en cuenta los resultados previos de nuestro laboratorio en el modelo murino, nos planteamos estudiar el posible rol que cumple PKA en la modulación del Em en el espermatozoide humano. Nuestros experimentos mostraron resultados opuestos a los encontrados en ratón ya que, al inhibir el eje cAMP/PKA, se evidenció una mayor hiperpolarización en lugar de una despolarización celular. Esto sugiere que la regulación del proceso de capacitación en espermatozoides humanos comprende una señalización diferencial de los canales iónicos involucrados que no se ajusta a lo demostrado en el modelo murino. En conclusión, nuestros resultados aportan una integración del conocimiento básico de la capacitación espermática humana para potencialmente contribuir a un manejo más personalizado de los pacientes destinados a tratamientos de reproducción asistida.
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    Membrane potential assessment by fluorimetry as a predictor tool of human sperm fertilizing capacity
    (Frontiers Media, 2020-01-17) Baró Graf, Carolina; Ritagliati, Carla; Torres Monserrat, Valentina; Stival, Cintia Estefanía; Carizza, Carlos; Buffone, Mariano Gabriel; Krapf, Darío
    Mammalian sperm acquire the ability to fertilize eggs by undergoing a process known as capacitation. Capacitation is triggered as the sperm travels through the female reproductive tract. This process involves specific physiological changes such as rearrangement of the cell plasma membrane, post-translational modifications of certain proteins, and changes in the cellular permeability to ions – with the subsequent impact on the plasma membrane potential (Em). Capacitation-associated Em hyperpolarization has been well studied in mouse sperm, and shown to be both necessary and sufficient to promote the acrosome reaction (AR) and fertilize the egg. However, the relevance of the sperm Em upon capacitation on human fertility has not been thoroughly characterized. Here, we performed an extensive study of the Em change during capacitation in human sperm samples using a potentiometric dye in a fluorimetric assay. Normospermic donors showed significant Em hyperpolarization after capacitation. Em values from capacitated samples correlated significantly with the sperm ability to undergo induced AR, highlighting the role of hyperpolarization in acrosomal responsiveness, and with successful in vitro fertilization (IVF) rates. These results show that Em hyperpolarization could be an indicator of human sperm fertilizing capacity, setting the basis for the use of Em values as a robust predictor of the success rate of IVF.
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    ÍtemAcceso Abierto
    The sodium–proton exchangers sNHE and NHE1 control plasma membrane hyperpolarization in mouse sperm
    (Elsevier, 2024-10-24) Novero, Analia G.; Torres Rodríguez, Paulina; De la Vega Beltrán, José L.; Schiavi Ehrenhaus, Liza J.; Luque, Guillermina M.; Carruba, Micaela; Stival, Cintia Estefanía; Gentile, Iñaki; Ritagliati, Carla; Santi, Celia M.; Nishigaki, Takuya; Krapf, Diego; Buffone, Mariano Gabriel; Darszon, Alberto; Treviño, Claudia L.; Krapf, Darío; https://orcid.org/0009-0004-7481-2121; https://orcid.org/0000-0002-2745-8236; https://orcid.org/0000-0002-2833-5553; https://orcid.org/0000-0002-7281-0534; https://orcid.org/0000-0001-7607-1954
    Sperm capacitation is a complex process that takes place in the female reproductive tract and empowers mammalian sperm with the competence to fertilize an egg. It consists of an intricate cascade of events that can be mimicked in vitro through incubation in a medium containing essential components, such as bicarbonate, albumin, Ca2+, and energy substrates, among others. Genetic and pharmacological studies have underscored the unique significance of the K+ channel SLO3 in membrane potential hyperpolarization, as evidenced by the infertility of mice lacking its expression. Notably, two key molecular events, sperm hyperpolarization and intracellular alkalinization, are central to the capacitation process. SLO3 is activated by alkalinization. However, the molecular mechanisms responsible for intracellular alkalization and activation of SLO3 are not completely understood. In this study, we examined the impact of Na+/H+ exchangers (NHEs) on mouse sperm membrane hyperpolarization during capacitation. Pharmacological inhibition of the NHE1 blocked membrane hyperpolarization. A similar effect was observed in sperm deficient of the Ca2+ channel CatSper because of NHE1 not being activated by Ca2+. In addition, the sperm-specific NHE (sNHE) KO did not show membrane hyperpolarization upon capacitation or induction with cAMP analogs. Our results show that sNHE is dually modulated by cAMP and membrane hyperpolarization probably through its cyclic nucleotide–binding domain and the voltage-sensor motif, respectively. Together, sNHE and NHE1 provide the alkalinization need for SLO3 activation during capacitation.