Examinando por Autor "Arranz, Silvia Eda"
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Ítem Acceso Abierto Cambios fisiológicos del espermatozoide de vertebrados : bases moleculares de su activación(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2011-10-20) O´Brien, Emma; Arranz, Silvia EdaUn espermatozoide móvil es uno de los requisitos necesarios para que se dé la fecundación de manera exitosa. En animales de fecundación externa los espermatozoides permanecen quiescentes en los testículos y durante la espermiación activan su motilidad. En los anfibios anuros como Bufo arenaurm, el contacto entre los gametos se da, primeramente, entre los espermatozoides y los factores que difunden rápidamente de la cubierta gelatinosa de los ovocitos (recuperados en una solución denominada EW, del inglés Egg Water). En este trabajo de tesis se estudiaron los factores del medio extracelular que activan el batido flagelar y los efectos de EW sobre los espermatozoides homólogos. Además se avanzó en el conocimiento de los mecanismos moleculares que gobiernan la activación flagelar. Para abordar estos estudios se realizaron ensayos bioquímicos y farmacológicos, utilizando como modelo espermatozoides del anfibio Bufo arenarum. En este trabajo de tesis se demuestra que la activación flagelar es iniciada por el choque hiposmótico del medio extracelular. Esta activación flagelar es reversible, sugiriendo la existencia de proteínas capaces de sensar cambios de presión osmótica. La activación flagelar está gobernada principalmente por dos vías de señalización: una dependiente de calcio y otra vía de señalización regulada por tmAC/AMPc/PKA. Además, se muestran evidencias que durante la activación flagelar se activarían proteínas serina/treonina fosfatasas que desfosforilan proteínas sustratos de PKC, localizadas en el flagelo del espermatozoide.Ítem Acceso Abierto Caracterización bioquímica y funcional de enzimas glucosídicas involucradas en la fecundación de vertebrados(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2015-03-20) Morales, Enrique Salvador; Arranz, Silvia EdaLa fecundación es un proceso complejo que requiere de múltiples eventos coordinados que llevan a la fusión del espermatozoide con el ovocito. Algunos de estos eventos requieren de interacciones proteína-carbohidrato. Una amplia evidencia experimental, obtenida en distintas especies, sugiere que glucosidasas de la superficie del espermatozoide podrían actuar a modo de lectina reconociendo azúcares específicos de la envoltura de los ovocitos (zona pelúcida en mamíferos o envoltura vitelina en anfibios) facilitando la unión de los gametos durante la fecundación. Además de este rol, se ha propuesto que glucosidasas del ovocito, que son liberadas luego de la fecundación, actuarían sobre los azúcares de las glucoproteínas que conforman su envoltura, modificando los sitios de unión al espermatozoide y contribuyendo de este modo con el bloqueo de la polispermia. La presencia de glucosidasas se ha reportado en los gametos de casi todas las especies de vertebrados estudiadas. Entre ellas, la enzima de origen lisosomal N-acetil--D-glucosaminidasa (EC 3.2.1.52), que metaboliza residuos de N-acetil glucosamina y/o N-acetil galactosamina terminales desde glucoconjugados, ha sido ligada tanto a la unión de las gametos como a la prevención de la polispermia en diversas especies de animales. En los anfibios, se ha informado que una Hex presente en los gránulos corticales de los ovocitos de X. laevis es liberada durante la reacción cortical (Greve y col., 1985), y que hidroliza residuos N-acetil glucosamina terminales de ZPC (Vo y col., 2003), una de las glucoproteínas que componen la envoltura vitelina (EV) de los ovocitos. La hidrólisis de estos residuos inhibe la fecundación, sugiriendo que los mismos actuarían como receptores espermáticos y que la Hex estaría asociada al bloqueo de la polispermia (Hedrick, 2008). Sin embargo, hasta el momento no se ha descripto la estructura molecular de ninguna Hex de anfibio, ni se han caracterizado las isoformas presentes en sus gametos. Por otra parte, son escasas las evidencias experimentales sobre el rol de la Hex en la fecundación en otras especies de anfibios. En este trabajo de tesis, utilizando secuencias conservadas de la región N-terminal, central y C-terminal de Hexs caracterizadas en mamíferos, se logró identificar la secuencia de ADNc de una putativa Hex de X. laevis a partir de una biblioteca de transcriptos. El ORF completo contenido en este ADNc se secuenció a partir del clon XL250c11ex obtenido del Instituto Nacional de Biología Básica de Japón (NIBB) y la secuencia se anotó en el GenBank (n° acceso JN127371). El ORF secuenciado (1662 pb) codificó un polipéptido de 553 residuos de aminoácidos. Estudios realizados in silico permitieron verificar que este polipéptido presenta una alta homología con las subunidades de Hexs previamente caracterizadas (>56 % identidad aminoacídica) y que conserva todos los residuos de aminoácido que conforman el sitio activo de las Hexs. La identidad Hex de esta proteína fue confirmada por la transfección del ADNc JN127371 en células de ovario de hámster chino (CHO). Estudios de Western blot, utilizando anticuerpos -Hex desarrollados en esta tesis, permitieron verificar la expresión de un polipéptido del tamaño esperado en los extractos celulares totales provenientes de las células transfectadas. Además, estos extractos mostraron un aumento de su actividad Hex cuando fueron comparados con los extractos provenientes de cultivos transfectados con un plásmido control. El gen codificante para la Hex caracterizada fue identificado en X. tropicalis. El estudio de su secuencia y la comparación por homología con ADNcs de ORF completo, tanto de X. laevis como de X. tropicalis, permitió predecir que dos Hexs distintas podrían ser originadas desde él, por medio del splicing alternativo de dos de sus exones. En los mamíferos, tres isoformas de la Hex (HexA, HexB y HexS) han sido caracterizadas, cada una compuesta por la homo o heterodimerización de dos subunidades distintas denominadas y . Estas subunidades pueden diferenciarse por sus sitios activos (Lemieux y col, 2006) y fue encontrado que están codificadas en genes separados que se cree que evolucionaron desde un gen ancestral común (Proia, 1988). El estudio de los sitios activos de las dos Hexs generadas por splicing alternativo a partir del gen caracterizado en Xenopus, y su comparación con los de las subunidades y que constituyen las Hexs de humano, mostró que una de estas Hex presenta un sitio activo de tipo , mientras que la otra presenta un sitio activo de tipo . Esto sugiere que en los anfibios las distintas isoformas de la Hex podrían generarse por splicing alternativo desde un mismo gen; a diferencia de los mamíferos donde se generan por subunidades codificadas en genes separados. Este hallazgo nos permitió hipotetizar, que el splicing alternativo pudo ser un mecanismo ancestral para la generación de las distintas isoformas de la Hex antes de que el gen ancestral de la Hex se duplicara y divergiera durante el curso de la evolución. Utilizando anticuerpos específicos obtenidos a partir de la expresión transgénica en E. coli de un fragmento N-terminal de la Hex codificada en el ADNc JN127371 se inmunocaracterizaron las Hexs presentes en los ovocitos de R. arenarum. La Hex fue encontrada tanto en el interior del citosol como en los gránulos corticales de los ovocitos. Esta localización fue confirmada por estudios de actividad enzimática realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato. La Hex de gránulos corticales fue liberada al espacio perivitelino durante la reacción cortical permitiendo suponer su participación en el bloqueo de la polispermia. En los espermatozoides de R. arenarum la Hex fue encontrada en las membranas apicales (plasmática y/o acrosomal externa) provenientes de la cabeza, en el contenido acrosomal y en los espermatozoides reaccionados. Estos hallazgos permiten suponer que la Hex de espermatozoides podría estar vinculada a la unión inicial de los gametos, y que podría participar en el pasaje del espermatozoide reaccionado a través de la EV del ovocito. El rol biológico de la Hex, y de otras glucosidasas, en la fecundación de R. arenarum, fue estudiado mediante ensayos de fecundación in vitro y experimentos de unión de espermatozoides a EVs aisladas. En estos ensayos se demostró que la inhibición de la Hex con el inhibidor específico competitivo 2-acetamido-2-deoxi-D-glucono-1,5-lactona disminuyó la tasa de fecundación de los ovocitos, de manera concentración dependiente. Además, tanto este inhibidor, como el pretratamiento de las EVs aisladas con una Hex comercial pura, fueron capaces de inhibir la unión de los espermatozoides a la EV, demostrando que la Hex presente en los espermatozoides de R. arenarum está involucrada en la unión primaria con el ovocito, reconociendo alguno de sus azúcares sustrato en la EV. Experimentos realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato, mostraron que la fucosidasa es la principal actividad glucosídica en los gránulos corticales de los ovocitos de R. arenarum, permitiendo suponer su participación en la prevención de la polispermia. La adición de fucosa como azúcar competidor en los ensayos de fecundación in vitro redujo significativamente la tasa de ovocitos fecundados. Sin embargo, la adición de fucosa no interfirió la unión de los espermatozoides a las EVs asiladas. Estos resultados sugieren que la fucosidasa participa en alguna de las etapas del proceso de fecundación de R. arenarum, pero no en la unión de los gametos a nivel de la EV.Ítem Acceso Abierto Diferenciación de vías actuantes en la hiperactivación y reacción acrosómica durante la adquisición de capacidad fecundante en mamíferos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2019-03-01) Stival, Cintia Estefanía; Krapf, Darío; Arranz, Silvia EdaLa capacitación es el proceso por el cual los espermatozoides de mamíferos adquieren la habilidad para fecundar un ovocito, y se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. La activación precisa de PKA depende de su adecuada localización en regiones subcelulares concretas. En este sentido, las Proteínas de Anclaje a PKA (AKAPs) forman andamiajes para generar microdominios de señalización y juegan un rol central en restringir la actividad de PKA a sitios específicos. Debido a que los procesos que se desencadenan a partir de la activación de PKA son esenciales para la adquisición de estado fecundante, entender cómo es que esta quinasa se regula en el espacio y tiempo es crucial para descifrar los pasos de la capacitación espermática. En este trabajo utilizamos espermatozoides murinos como modelo para la caracterización de las cascadas de transducción de señales que tienen lugar durante la capacitación. Para estudiar el rol de la interacción PKA-AKAPs se utilizó el péptido inhibidor de anclaje sHT31, en distintos momentos de la fisiología espermática. En primer lugar, validamos el uso de este compuesto, determinando que a las concentraciones de trabajo el péptido no bloquea la actividad catalítica de PKA, pero sí disocia la unión de PKA a AKAP4 en el espermatozoide. Demostramos que el anclaje de PKA a AKAPs es necesario para lograr el estado capacitado, ya que provocar su desanclaje al comienzo de la capacitación resultó en la inhibición de todos los eventos asociados: aparición del patrón de pPKAs, aparición del patrón de pY, hiperpolarización de la membrana plasmática, hiperactivación y capacidad de sufrir RA frente a progesterona. Sin embargo, encontramos que una vez que las células se han vuelto fecundantes, la interrupción repentina de la interacción PKA-AKAPs promueve un rápido influjo de Ca2+ a través del canal CatSper y resulta en la inducción de la RA sin agregado de progesterona. Estos resultados proponen un nuevo evento de señalización que vincula a CatSper con a la reacción acrosómica, en donde el canal es sensible a una activación por PKA provocada por su desanclaje de AKAPs. Por otra parte, debido a que la hiperpolarización del potencial de membrana (Em) es un evento intermedio fundamental en la vía que conduce a la capacidad de RA, y sabiendo que depende de PKA, decidimos estudiar la conexión molecular entre ambos sucesos. En este sentido, los espermatozoides de ratones knock-out en Src no pueden adquirir capacidad de respuesta acrosomal, sugiriendo un rol para la tirosina quinasa en esta vía de señalización durante la capacitación. Por ello, decidimos evaluar la participación de Src en los eventos de la capacitación que conducen a la preparación para desencadenar la RA. Nuestros resultados indican que Src es activada corriente abajo de PKA y que su inhibición bloquea la hiperpolarización del Em sin afectar al patrón de pY que acompaña a la capacitación. Además, la inhibición de Src impidió que los espermatozoides adquieran capacidad de RA frente a progesterona, lo cual pudo revertirse hiperpolarizando farmacológicamente a las células en presencia de inhibidores de Src. Evidencia complementaria sugiere que Src podría activar de manera directa o indirecta al canal de K+ Slo3 para lograr la hiperpolarización del Em durante la capacitación espermática, evento que a su vez es necesario para la adquisición de capacidad de respuesta acrosómica. En conjunto nuestros resultados aportan nuevos datos en el entendimiento de las cascadas de señalización que ocurren durante la capacitación espermática, evidenciando el rol central de PKA como modulador de la misma. PKA podría ser un componente esencial, no sólo en las vías de transducción que conducen a la capacitación, sino también en la regulación de la exocitosis acrosomal una vez que los espermatozoides alcanzaron el estado capacitado. Esta función de PKA requiere tanto de la regulación de su actividad como de su localización subcelular.Ítem Acceso Abierto Estudio de la miogénesis en peces teleósteos(2021) Faggiani, Mariano; Arranz, Silvia Eda; Rubiolo, Juan AndrésEl crecimiento del músculo esquelético está condicionado por 1) el aumento en tamaño de las fibras musculares (hipertrofia) y 2) por el aumento en el número de fibras musculares (hiperplasia). Las células responsables de ambos procesos son las células precursoras miogénicas (MPCs), pero los mecanismos que las llevan a optar por un camino u otro son aún desconocidos. En este trabajo se estudiaron los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los procesos de hiperplasia e hipertrofia muscular en el pejerrey bonaerense (Odontesthes bonariensis). Se logró por primera vez en esta especie, realizar cultivos primarios de MPCs a partir de extractos de músculo blanco de juveniles, identificándose 3 poblaciones: 1) células MyoD- pequeñas esférica y con alta relación núcleo/citoplasma; 2) células MyoD+ con las mismas características morfológicas que las células del punto anterior y 3) células MyoD+ de mayor tamaño, baja relación núcleo/citoplasma y forma estrellada. El análisis del estado proliferativo utilizando EdU permitió determinar que las poblaciones identificadas en cultivo primario como MyoD+ son MPCs que se han activado, mientras que las células MyoD- esféricas corresponderían a MPCs quiescentes. A continuación, se estudió el proceso de diferenciación in vitro en cultivos celulares durante 72 hs. Se determinó que inicialmente las MPCs quiescentes presentan forma esférica pequeña. Posteriormente, se activan y expresan MyoD. La expresión de MyoD se sostiene durante el resto del programa de diferenciación y fusión celular. Seguidamente, estas células aumentan su tamaño y emiten proyecciones citoplasmáticas mediante las cuales pueden migrar, adquiriendo forma estrellada. Al completar su diferenciación a miocitos adquieren forma de huso para posteriormente entrar en contacto entre sí y fusionarse formando miotubos multinucleados. El desarrollo del cultivo primario de MPCs nos permitió estudiar, a nivel celular, el fenómeno de crecimiento compensatorio en músculo, el cual consiste en el crecimiento acelerado que puede tener lugar luego de un período de ayuno y posterior realimentación. En Odontesthes bonariensis el ayuno inhibe la hipertrofia muscular pero no tiene efectos sobre la hiperplasia. Con el objetivo de evaluar cómo influye la falta de alimento en la proliferación y diferenciación de células musculares, se ayunaron juveniles de pejerrey y luego se aislaron y analizaron las MPCs in vitro utilizando un medio de cultivo rico en nutrientes para emular la condición de realimentación. Si bien se apreció una reducción significativa de la proliferación celular in vivo durante el ayuno, se determinó que las MPCs aisladas de peces ayunados presentaron una mayor velocidad de diferenciación que las aisladas de peces control, sugiriendo que las MPCs adquieren un condicionamiento metabólico como consecuencia de la privación de alimento que determinaría que al encontrarse con una fuente de energía se induzca rápidamente su diferenciación y fusión. Estos datos fundamentan a nivel celular el aumento de la velocidad de hipertrofia observado en peces realimentados. Adicionalmente, se realizó el análisis transcriptómico por RNAseq del tejido muscular de peces ayunados y peces realimentados, identificándose 2.516 genes expresados diferencialmente. Se determinó que durante el ayuno se reprimen genes asociados a la proliferación celular y a síntesis de matriz extracelular, indicando que el crecimiento muscular se inhibe. Contrariamente, la sobreexpresión de genes que intervienen en el catabolismo de lípidos y proteínas, evidencia la movilización de reservas y componentes celulares hacia la producción de energía en un contexto de carencia de nutrientes externos. En concordancia, se advirtió activada la vía de autofagia, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la fosforilación oxidativa, lo que aumenta la eficiencia en la utilización de energía. Esto sugiere un cambio de las vías de obtención de ATP, pasando de un metabolismo anaeróbico propio del músculo blanco hacia un metabolismo aeróbico. El hecho de que las células musculares expresen esta maquinaria metabólica altamente eficiente activada al momento de reestablecerse la alimentación, podría justificar el rápido y efectivo aprovechamiento de nutrientes que impulsa la diferenciación de MPCs, permitiendo un súbito crecimiento del tejido muscular por hipertrofia. Este trabajo de tesis sienta de esta forma por primera vez las bases celulares y moleculares para comenzar a comprender el crecimiento compensatorio en el modelo O. bonariensis.Ítem Acceso Abierto Estudio de la secreción de oviducto en Bufo arenarum y su relación en el proceso de fecundación(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1998-04) Arranz, Silvia Eda; Cabada, Marcelo O.El reconocimiento entre el espermatozoide y el ovocito constituye la primera etapa del proceso de fecundación. En Anfibios Anuros, ese primer contacto ocurre entre el espermatozoide y la cubierta gelatinosa que rodea los ovocitos. En este trabajo de tesis se describe: (A) la identificación y purificación de la proteína estructural mayoritaria (HGP) de cubiera gelatinosa de ovocitos de Bufo arenarum a partir de la secreción de oviducto, donde se originan los componentes de la misma; el sitio de síntesis de HGP en oviducto y su caracterización estructural, (B) la purificación y caracterización de una glicoproteína difusible (L-HGP) de cubierta gelatinosa y su sitio de síntesis; (C) la función biológica de L-HGP y (D) el estudio de los componentes estables y difusibles de cubierta gelatinosa de ovocitos de Bufo arenarum. […]Ítem Acceso Abierto First DNA barcode reference library for the identification of South American freshwater fish from the lower Paraná River(Public Library of Science (PLOS), 2016-07-21) Díaz, Juan; Villanova, Gabriela Vanina; Brancolini, Florencia; Del Pazo, Felipe; Posner, Victoria María; Grimberg, Alexis; Arranz, Silvia EdaÍtem Acceso Abierto Identificación y caracterización de nuevos miembros de la familia de receptores de hormonas de crecimiento en peces teleósteos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2012-04-20) Di Prinzio, Cecilia Mayra; Arranz, Silvia EdaDado que el crecimiento de organismos acuáticos es el aspecto más importante en el desarrollo de las actividades tendientes a su aprovechamiento, tener conocimientos suficientes sobre este proceso es fundamental, sobre todo en las etapas tempranas de la vida de los organismos, ya que suelen ser las menos estudiadas y las más problemáticas a nivel productivo. En los vertebrados, el eje somatotrópico, con la hormona de crecimiento (GH) como pieza central, regula el crecimiento integrando los múltiples factores que lo influencian. Sin embargo, en los peces, GH está implicada en múltiples funciones fisiológicas, además del crecimiento, lo que hace al sistema relativamente más complejo. Sus acciones son iniciadas por su unión al receptor (GHR), localizado en la membrana celular de los tejidos diana. En el presente trabajo de tesis, trabajando con el organismo modelo Danio rerio, se caracterizaron dos tipos de ghrs, denominados ghra y ghrb, que se corresponden con los GHR de tipo I y de tipo II caracterizados en peces hasta el momento. Al estudiar sus patrones de expresión temporal en los tejidos adultos, la misma se observó en hígado, al igual que en el resto de las especies estudiadas, aunque también se observó expresión en otros tejidos, corroborando las funciones pleiotrópicas de GH. Los estudios de expresión temporal y espacio-temporal de los ghrs durante el desarrollo embrionario mostraron que ambos son de origen materno y continúan expresándose a lo largo del desarrollo temprano, inicialmente de forma ubicua y luego se van localizando en estructuras específicas del embrión, con posible relevancia funcional. Utilizando anticuerpos policlonales contra el dominio extracelular GHRa, desarrollados en nuestro laboratorio, se determinó, por primera vez, que esta proteína es de origen materno y su expresión se mantiene durante todo el desarrollo embrionario temprano y tardío, lo que sugiere un rol importante para este receptor en la vida temprana del pez. Estudios de la expresión espacio-temporal de GHRa mostraron que la proteína coexistiría especialmente y temporalmente con su ARNm. Mediante la utilización de técnicas de transgénesis y de silenciamiento génico temporal, se observó que GHRa estaría implicada en el desarrollo y/o funcionamiento de la vejiga natatoria. Estudios más profundos sobre las cascadas de expresión de genes en los diferentes órganos o tejidos en los que se expresa durante el desarrollo embrionario permitirían dilucidar su función en los mismos.Ítem Acceso Abierto Robust and scalable barcoding for massively parallel long‑read sequencing(Nature Research, 2022-12) Ezpeleta, Joaquín; Labari, Ignacio Garcia; Villanova, Gabriela Vanina; Bulacio, Pilar; Lavista Llanos, Sofía; Posner, Victoria María; Krsticevic, Flavia; Arranz, Silvia Eda; Tapia, Elizabeth