Examinando por Autor "Altabe, Silvia Graciela"
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Ítem Acceso Abierto Biochemical characterization of the minimal domains of an iterative eukaryotic polyketide synthase(Wiley, 2018-10-25) Sabatini, Martín; Comba, Santiago; Altabe, Silvia Graciela; Recio Balsells, Alejandro Iván; Labadie, Guillermo Roberto; Takano, Eriko; Gramajo, Hugo Cesar; Arabolaza, Ana LorenaÍtem Acceso Abierto Caracterización funcional de acil-lípido desaturasas de Bacillus sp. : determinantes estructurales de la especificidad de sustrato y dadores electrónicos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-03-18) Chazarreta Cifré, Lorena; Altabe, Silvia GracielaLos ácidos grasos insaturados (AGI) son componentes esenciales de la membrana celular. Los organismos vivos, en particular los poiquilotermos, responden a una disminución en la temperatura aumentando la proporción de AGI. Este fenómeno ha sido designado con el nombre de adaptación homeoviscosa 1. Los AGI son sintetizados por desaturasas, un tipo especial de oxigenasas que tienen la capacidad de remover dos hidrógenos de una cadena hidrocarbonada, especialmente de cadenas de ácidos grasos (AG), catalizando la formación de un doble enlace en el sustrato en forma altamente estéreo-, regio- y quimio- selectiva 2. Hasta el momento, no se conocen las bases moleculares que expliquen este grado de sofisticación de estas enzimas. La gran mayoría de las desaturasas se encuentran unidas a membrana, lo que dificulta la obtención de grandes cantidades en forma activa, y por consiguiente el entendimiento de las propiedades particulares de su actividad enzimática. El estudio de desaturasas bacterianas con actividades diferentes, sobre sustratos similares, y estructura primaria similar presenta una oportunidad única para llevar a cabo estudios sobre la relación estructura-función de estas enzimas. En bacterias Gram positivas la única desaturasa de AG caracterizada es la Δ5 desaturasa de Bacillus subtilis 3. El análisis de la composición lipídica de cepas de B. subtilis reveló que esta bacteria sintetiza exclusivamente AGI con el doble enlace en la posición 5 y los estudios complementarios realizados revelaron que esta bacteria posee una única acil lípido desaturasa denominada Des que cataliza la introducción de dobles enlaces en la posición 5 con distintos sustratos, no mostrando preferencia por la longitud de cadena 3. Esta desaturasa se induce a bajas temperaturas y su expresión se encuentra regulada por un sistema de dos componentes, DesK-DesR (DesK/R) 4. Estudios realizados por Fulco 5 demostraron que algunas especies de bacilos sintetizaban AGI con el doble enlace en la posición 5, mientras que en otras se encontró un espectro de isómeros de dobles enlaces centrados alrededor de la posición 9 y sobre AG de distinta longitud de cadena6. En Bacillus licheniformis 9259 se observaron tanto AGI en la posición 5 como en la posición 10, y se propuso que al menos dos desaturasas distintas estaban involucradas 7. Otros grupos observaron que Bacillus cereus sintetiza AGI Δ5, Δ10 y Δ5,10 8. Esta diversidad de actividades hacen del género Bacillus una fuente natural de desaturasas que podría ser utilizada para comprender los mecanismos moleculares que gobiernan la especificidad de sustrato. Además, la gran cantidad y diversidad de AGI sintetizados por estos organismos los convierten en excelentes modelos para comprender la funcionalidad de las desaturasas y estudiar los mecanismos que regulan su expresión. Los resultados presentados en este Trabajo de Tesis permitieron contribuir al conocimiento de la función y regulación de las desaturasas de B. cereus ATCC 14579 y B. licheniformis ATCC 14580. Se comprobó que B. licheniformis posee una única acil lípido desaturasa, DesL que tiene actividad Δ5. Cuando cultivos de esta bacteria se transfieren de 37°C a 25°C la cantidad de AGI aumenta 2 veces, de 3% a 6%, lo cual sugirió que la expresión o actividad de esta enzima se encuentra regulada por la temperatura de crecimiento. Posteriormente se pudo demostrar que la expresión del gen desL se encuentra regulada por un mecanismo similar al descripto previamente en nuestro laboratorio para B. subtilis, en el que estaría involucrado un sistema de dos componentes similar a DesK/R. Se determinó que B. cereus posee dos desaturasas denominadas DesA y DesB. Ambas proteínas son acil lípido desaturasas con actividad Δ5 y Δ10, respectivamente. Estas dos enzimas son las responsables de sintetizar la gran cantidad de AGI que produce B. cereus tanto a 37°C (27%) como a 25°C (45%). Este aumento en la síntesis de AGI al disminuir la temperatura de crecimiento se debería a un incremento en la expresión del gen desA y a un aumento en la actividad de DesB, ya que el gen desB se expresaría de manera constitutiva. Estudios fisiológicos realizados con mutantes obtenidas en el gen desA, mostraron que esta desaturasa no es esencial para el crecimiento bacteriano en ninguna condición ensayada. Por otro lado la ausencia de DesB inhibe completamente el crecimiento de B. cereus en medio mínimo (MM). Este defecto no pudo ser corregido por el agregado de AGI exógenos en este medio debido a que el suplemento en este medio fue insuficiente para corregir la deficiencia de AGI o a los efectos líticos que produce el agregado externo de los mismos al medio de cultivo. La recuperación del crecimiento se logró luego del agregado de aminoácidos (AA) precursores de ácidos grasos ramificados (AGR) al medio de cultivo, o de AA no precursores más AGI exógenos. Esto estaría sugiriendo que es necesaria una combinación de AGR y AGI que provean fluidez a la membrana para permitir el crecimiento. En este sentido se pudo determinar que el agregado de precursores de los AGR, en particular la isoleucina, rescata el crecimiento en forma parcial. Los AGR presentan bajos puntos de fusión al igual que los AGI y permiten fluidificar la membrana en ausencia de los mismos. Esta la primera vez que se describe la esencialidad de una desaturasa para el crecimiento bacteriano en estas condiciones. Finalmente, todos los resultados obtenidos en esta Tesis han contribuido a la caracterización de desaturasas del género Bacillus con el fin de comenzar a comprender las bases moleculares que gobiernan el proceso de desaturación. Además la identificación de genes homólogos a desB, esencial para el crecimiento de B. cereus, en otras especies Gram positivas, incluyendo otros patógenos humanos, indica que la información sobre esta proteína descripta en este trabajo podría ser utilizada para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos.Ítem Acceso Abierto Cerulenin inhibits unsaturated fatty acids synthesis in Bacillus subtilis by modifying the input signal of DesK thermosensor(Wiley, 2014-04-09) Porrini, Lucía; Cybulski, Larisa Estefanía; Altabe, Silvia Graciela; Mansilla, María Cecilia; De Mendoza, DiegoBacillus subtilis responds to a sudden decrease in temperature by transiently inducing the expression of the des gene encoding for a lipid desaturase, Δ5-Des, which introduces a double bond into the acyl chain of preexisting membrane phospholipids. This Δ5-Des-mediated membrane remodeling is controlled by the cold-sensor DesK. After cooling, DesK activates the response regulator DesR, which induces transcription of des. We show that inhibition of fatty acid synthesis by the addition of cerulenin, a potent and specific inhibitor of the type II fatty acid synthase, results in increased levels of short-chain fatty acids (FA) in membrane phospholipids that lead to inhibition of the transmembrane-input thermal control of DesK. Furthermore, reduction of phospholipid synthesis by conditional inactivation of the PlsC acyltransferase causes significantly elevated incorporation of long-chain FA and constitutive upregulation of the des gene. Thus, we provide in vivo evidence that the thickness of the hydrophobic core of the lipid bilayer serves as one of the stimulus sensed by the membrane spanning region of DesK.Ítem Acceso Abierto Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves(Nature, 2018-04-23) Galles, Celina; Prez, Gastón M.; Penkov, Sider; Boland, Sebastian; Porta, Exequiel Oscar Jesús; Altabe, Silvia Graciela; Labadie, Guillermo Roberto; Schmidt, Ulrike; Knölker, Hans-Joachim; Kurzchalia, Teymuras V.; De Mendoza, DiegoÍtem Acceso Abierto MapB, the Brucella suis TamB homologue, is involved in cell envelope biogenesis, cell division and virulence(Springer Nature, 2019-02-15) Bialer, Magalí Graciela; Ruiz-Ranwez, Verónica; Sycz, Gabriela; Estein, Silvia Marcela; Russo, Daniela Marta; Altabe, Silvia Graciela; Sieira, Rodrigo; Zorreguieta, Ángeles; De Bolle, Xavier: provide the anti-OMPs and anti-LPS antibodies; Ugalde, Juan: provide the anti-OMPs and anti-LPS antibodies; Cassataro, Juliana: provide the anti-OMPs and anti-LPS antibodies; Spera, Juan Manuel: provide the PQE31-3xFLAG plasmid; Bravo, Marta: DNA sequencingBrucella species are Gram-negative, facultative intracellular pathogens responsible for a worldwide zoonosis. The envelope of Brucella exhibits unique characteristics that make these bacteria furtive pathogens and resistant to several host defence compounds. We have identified a Brucella suis gene (mapB) that appeared to be crucial for cell envelope integrity. Indeed, the typical resistance of Brucella to both lysozyme and the cationic lipopeptide polymyxin B was markedly reduced in a ∆mapB mutant. MapB turned out to represent a TamB orthologue. This last protein, together with TamA, a protein belonging to the Omp85 family, form a complex that has been proposed to participate in the translocation of autotransporter proteins across the outer membrane (OM). Accordingly, we observed that MapB is required for proper assembly of an autotransporter adhesin in the OM, as most of the autotransporter accumulated in the mutant cell periplasm. Both assessment of the relative amounts of other specific outer membrane proteins (OMPs) and a proteome approach indicated that the absence of MapB did not lead to an extensive alteration in OMP abundance, but to a reduction in the relative amounts of a protein subset, including proteins from the Omp25/31 family. Electron microscopy revealed that ∆mapB cells exhibit multiple anomalies in cell morphology, indicating that the absence of the TamB homologue in B. suis severely affects cell division. Finally, ∆mapB cells were impaired in macrophage infection and showed an attenuated virulence phenotype in the mouse model. Collectively, our results indicate that the role of B. suis TamB homologue is not restricted to participating in the translocation of autotransporters across the OM but that it is essential for OM stability and protein composition and that it is involved in cell envelope biogenesis, a process that is inherently coordinated with cell division.Ítem Acceso Abierto Structural determinant of functionality in acyl lipid desaturases(Elsevier, 2018-10) Sastre, Diego Emiliano; Saita, Emilio Adolfo; Uttaro, Antonio Domingo; De Mendoza, Diego; Altabe, Silvia GracielaLittle is known about the structure-function relationship of membrane-bound lipid desaturases. Using a domain-swapping strategy, we found that the N terminus (comprising the two first transmembrane segments) region of Bacillus cereus DesA desaturase improves Bacillus subtilis Des activity. In addition, the replacement of the first two transmembrane domains from Bacillus licheniformis inactive open reading frame (ORF) BL02692 with the corresponding domain from DesA was sufficient to resurrect this enzyme. Unexpectedly, we were able to restore the activity of ORF BL02692 with a single substitution (Cys40Tyr) of a cysteine localized in the first transmembrane domain close to the lipidwater interface. Substitution of eight residues (Gly90, Trp104, Lys172, His228, Pro257, Leu275, Tyr282, and Leu284) by site-directed mutagenesis produced inactive variants of DesA. Homology modeling of DesA revealed that His228 is part of the metal binding center, together with the canonical His boxes. Trp104 shapes the hydrophobic tunnel, whereas Gly90 and Lys172 are probably involved in substrate binding/recognition. Pro257, Leu275, Tyr282, and Leu284 might be relevant for the structural arrangement of the active site or interaction with electron donors. This study reveals the role of the N-terminal region of 5 phospholipid desaturases and the individual residues necessary for the activity of this class of enzymes.Ítem Acceso Abierto The role of cell-envelope synthesis for envelope growth and cytoplasmic density in Bacillus subtilis(Oxford University Press, 2022-07-26) Kitahara, Yuki; Oldewurtel, Enno R.; Wilson, Sean; Sun, Yingjie; Altabe, Silvia Graciela; De Mendoza, Diego; Garner, Ethan C.; Van Teeffelen, Sven; http://orcid.org/0000-0001-8034-9058; http://orcid.org/0000-0002-2813-0259; http://orcid.org/0000-0002-7216-9804; http://orcid.org/0000-0002-1309-753X; http://orcid.org/0000-0003-0141-3555; http://orcid.org/0000-0002-0877-1294All cells must increase their volumes in response to biomass growth to maintain intracellular mass density within physiologically permissive bounds. Here, we investigate the regulation of volume growth in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. To increase volume, bacteria enzymatically expand their cell envelopes and insert new envelope material. First, we demonstrate that cell-volume growth is determined indirectly, by expanding their envelopes in proportion to mass growth, similarly to the Gram-negative Escherichia coli, despite their fundamentally different envelope structures. Next, we studied, which pathways might be responsible for robust surface-to-mass coupling: We found that both peptidoglycan synthesis and membrane synthesis are required for proper surface-tomass coupling. However, surprisingly, neither pathway is solely rate-limiting, contrary to wide-spread belief, since envelope growth continues at a reduced rate upon complete inhibition of either process. To arrest cell-envelope growth completely, the simultaneous inhibition of both envelope-synthesis processes is required. Thus, we suggest that multiple envelope-synthesis pathways collectively confer an important aspect of volume regulation, the coordination between surface growth, and biomass growth.