Examinando por Autor "Aguilar Lucero, Dianela Ailin"

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    Regulación y especificidad del sistema proteolítico clp de plantas
    (2022) Aguilar Lucero, Dianela Ailin; Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo Augusto
    La correcta eliminación de proteínas del medio celular constituye un mecanismo de control de calidad esencial que asegura la proteostasis. El reconocimiento adecuado del sustrato es vital para evitar la eliminación de proteínas útiles. Por esta razón, los complejos proteolíticos detectan señales de degradación en sus objetivos. Por ejemplo, los determinantes de secuencia llamados degrones marcan las proteínas para su eliminación. En particular, los residuos específicos en el extremo amino (N-degrones) son una característica de las proteínas de vida corta. La regulación de la vida media de una proteína por la identidad de su región N-terminal se conoce como la “vía N-degrón”. En Escherichia coli, el sistema proteolítico Clp está formado por. ClpP, una proteasa que se asocia con los chaperones Hsp100 ClpA o ClpX. Los monómeros de ClpP se autoensamblan en un tetradecámero en forma de barril. Los chaperones reconocen el objetivo y lo presentan a ClpP. Por ejemplo, ClpA se oligomeriza en un anillo hexámerico que se ancla a los poros de ClpP. Los degrones se unen a ClpA y son desplegados y entregados a ClpP para su procesamiento. ClpS es una proteína adaptadora de ClpA que se une a sus objetivos y los entrega a ClpAP. Reconoce los residuos N-terminales: fenilalanina, tirosina, triptófano y leucina. ClpS contiene una extensión N-terminal desordenada y un núcleo central plegado que presenta una cavidad hidrófoba en la que encajan los residuos desestabilizantes. El reconocimiento requiere un extremo N-terminal libre, ya que la N-acetilación anula la unión a ClpS. Los cloroplastos retienen muchos de los sistemas moleculares presentes en las bacterias, siendo el sistema Clp uno de ellos. En los cloroplastos de Arabidopsis thaliana, la cámara proteolítica está formada por nueve subunidades diferentes (ClpP1, ClpP3-6 y ClpR1-4). Las plantas no poseen homólogos de secuencia de ClpA, pero en cambio, los chaperones ClpC (ClpC1 y ClpC2) y ClpD cumplen su función. El adaptador asociado es ClpS1, que presenta gran homología de secuencia con ClpS, lo que sugiere que los objetivos de ClpS1 podrían seguir la vía N-degrón bacteriana. Finalmente, los cloroplastos presentan otro componente llamado ClpF cuya función todavía no está del todo definida. ClpF estimula la unión de ClpS1 a chaperones ClpC; por tanto, podría actuar como un facilitador de la interacción ClpS1-Hsp100, regular la especificidad de ClpS1 o unirse a N-degrones por sí sola. Hay muchas preguntas abiertas con respecto a la función, especificidad, el modo de acción y las características estructurales de ClpS1. Además, se desconocen los efectos de la acetilación N-terminal en la diana. A su vez, el rol de ClpF es incierto. En este trabajo, se analizaron los determinantes de secuencia que regulan la especificidad de ClpS1 cloroplástica. Se utilizó una combinación de matrices de péptidos, anisotropía de fluorescencia y resonancia magnética nuclear (RMN) y construcción de quimeras para comprender el proceso de reconocimiento y la especificidad de sustrato por ClpS1. Para muchas proteínas ClpS bacterianas, se utilizaron con éxito matrices de péptidos para descubrir sus patrones de reconocimiento. En este trabajo, se usaron matrices peptídicas para estudiar la especificidad de ClpS1. Mediante esta técnica se pudo determinar que ClpS1 reconoce los cuatro residuos (fenilalanina, leucina, tirosina y triptófano) afines de la vía N-degrón bacteriana, pero la identidad del segundo residuo influye en la unión. El mismo ensayo utilizando una membrana peptídica N-acetilada mostró que ClpS1 no es capaz de reconocer y unirse a ningún péptido que se encuentre N-acetilado. Asimismo, para conocer si la presencia de ClpF modifica la capacidad de unión a los péptidos o la especificidad de ClpS1, se repitió el ensayo con las membranas peptídicas y se observó que ClpF no se une a los extremos N-terminales por sí solo ni altera la especificidad de ClpS1. Para obtener una mejor comprensión de la estructura de ClpS1 y sus propiedades de unión al ligando, realizamos un análisis de RMN de la proteína marcada isotópicamente. Este análisis mostró que ClpS1 contiene una región intrínsecamente desordenada y una plegada, rica en elementos de estructura secundaria. Curiosamente, el extremo N-terminal de ClpS1 no presenta un comportamiento de espiral aleatorio puro, sino que muestra dos subregiones con propensión a poblar estructuras secundarias de hoja β y hélice α. Los resultados de la matriz de péptidos indican que ClpS1 se une con alta afinidad a péptidos con Phe y Trp en el extremo N-terminal. Por esta razón, estudiamos mediante RMN la unión de ligandos utilizando análogos de estos dos aminoácidos, L-Phe-amida y L-Trp-amida. Los resultados indican que ClpS1 se une a L-Phe-amida con alta afinidad (Kd <10 μM). También revelaron que el sitio de unión está ubicado entre la primera y la segunda hélice α y la porción N-terminal de la primera hoja β. Así la región más afectada por la unión de L-Phe-amida es el bolsillo hidrófobo presente en la región globular de ClpS1. L-Trp-amida dio perfiles similares, aunque con efectos más pronunciados. Para determinar de forma precisa las afinidades de unión a estos interactuantes se realizó anisotropía de fluorescencia. ClpS1 se unió a L-Trp-amida con una Kd de 2,20 ± 0,33 μM, dentro del valor esperado de acuerdo con los experimentos de titulación de RMN. Se estableció un ensayo de competencia de anisotropía para calcular el Kd para la unión de ClpS1 a L-Phe-amida. ClpS1 se unió a L-Phe-amida con afinidad similar a la LTrp-amida. Con el fin de conocer la especificidad y especificidad de ClpS1, se estudió la posibilidad de utilizar el sistema ClpAP de E. coli junto con ClpS1. En base a esto se construyeron cinco quimeras utilizando la estructura de ClpS1 e intercambiando distintos segmentos por los correspondientes a ClpS de E. coli que podrían estar involucrados en la unión al chaperón y entrega del sustrato. Las quimeras se clonaron y purificaron exitosamente. Se realizaron ensayos de sustitución de ClpS por las distintas quimeras y no se observó degradación del sustrato fluorescente en presencia de ninguna de las quimeras. Los ensayos de competencia realizados con las quimeras, mostraron que todas compiten por el sustrato con ClpS1, aunque en diferente grado. Estos resultados representan un nuevo paso en la comprensión del reconocimiento de objetivos por parte del sistema Clp en orgánulos de plantas y son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta tesis.