Gardiol, Daniela2023-08-042023-08-042023http://hdl.handle.net/2133/26109El virus Zika (ZIKV) pertenece al género de los Flavivirus (FV). Como muchos miembros de este género, posee un genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva relativamente pequeño de sólo 11.000 bases, viriones con una envoltura lipídica y un tamaño promedio de 50 nm. Sin embargo, también cuenta con características únicas que lo distingue de otros FV. Durante mi trabajo de tesis doctoral, nos enfocamos en el estudio de los mecanismos relacionados a dos de estas características distintivas de ZIKV. Por un lado, investigamos la gran capacidad de ZIKV de diseminarse dentro de su hospedador. Este virus logra infectar tejidos de difícil acceso para la mayoría de los patógenos humanos, como es el tejido nervioso central. Para lograrlo, debe ser capaz de atravesar complejas barreras biológicas. Sin embargo, los mecanismos que emplea para esto permanecen sin comprenderse completamente. Por lo tanto, decidimos abordar esta incógnita, a través de distintos modelos experimentales. Inicialmente, nos enfocamos en investigar la posibilidad de que ZIKV logre alterar la integridad de las uniones intercelulares (UI) como parte de un mecanismo de patogenicidad que facilite atravesar barreras biológicas por una vía paracelular. Para ello, desarrollamos un modelo de infección in vitro de ZIKV, en colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) “Dr. Julio Maiztegui”, donde obtuvimos acceso a 3 aislamientos virales de ZIKV. Utilizando dicho modelo realizamos ensayos de inmunofluorescencia (IF) para evidenciar cambios en la abundancia y localización de proteínas celulares constituyente de las UI. Seleccionamos a la proteína celular Ocludina como marcador de la integridad de las uniones estrechas y a la proteína DLG1 (del inglés Disc Large 1) como marcador de integridad de las uniones adherentes. Además, para evaluar de forma más precisa y reproducible los cambios que podrían sufrir estas proteínas durante la infección por ZIKV, desarrollamos un algoritmo de cuantificación automatizada de la fluorescencia asociada a la expresión de dichas proteínas celulares, basado en la segmentación de las imágenes. Luego del análisis cuantitativo de imágenes obtenidas a partir de ensayos de IF, observamos una reducción en los niveles de expresión de las proteínas Ocludina y DLG1 tras la infección con distintas cepas virales, aunque sin cambios significativos en la localización subcelular de tales marcadores. Estos resultados nos alentaron a buscar la existencia de mecanismos alternativos o complementarios que podrían influir en la diseminación del virus dentro de sus hospedadores. Por lo tanto, estudiamos la posibilidad de que el virus emplee mecanismos transcelulares de diseminación, en donde manipularía a su favor componentes de las vías secretoras celulares para facilitar su transporte y liberación dentro de la células que componen las barreras biológicas. En este contexto, analizamos factores celulares que podrían estar implicados en las etapas tardías del ciclo de replicación de ZIKV, que hasta el momento resultan poco comprendidas. Para esto, realizamos ensayos de proteómica donde evaluamos los cambios en el proteoma de células humanas en presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV. Esta es la única proteína viral de ZIKV que es secretada al espacio extracelular y se ha reportado que participa tanto en los mecanismos de ensamblaje como de liberación de las partículas virales. Nos enfocamos en buscar posibles proteínas celulares relacionadas a mecanismos de transporte intracelular que hubiesen cambiado su nivel de expresión en presencia de NS1. Interesantemente, encontramos que la proteína celular sinaptotagmina-9 (SYT9) mostró un gran aumento de sus niveles de expresión en presencia de dicha proteína viral. SYT9 es una proteína celular poco estudiada hasta el momento, aunque existen reportes que sugieren que podría ser crucial en mecanismos de transporte intracelulares asociados a vesículas en diversos tejidos. Este hallazgo resultó muy interesante si se contempla que tanto NS1 como los nuevos viriones de ZIKV producidos durante una infección, son liberados de las células mediante transporte vesicular. Por lo tanto, nos propusimos realizar ensayos de microscopia confocal de fluorescencia y Western Blot (WB) para profundizar dicho hallazgo. En este contexto, pudimos demostrar que la presencia de proteínas virales relacionadas a la liberación y ensamblado de los nuevos viriones de ZIKV como son NS1 o la proteína estructural de la envoltura (E), incrementan significativamente la expresión de la proteína celular SYT9. Además, en los ensayos de microscopía confocal de fluorescencia fue posible evidenciar que NS1 y E de ZIKV inducen una fuerte redistribución de SYT9 con un intenso patrón de co-localización con ambas proteínas virales. Además, pudimos reforzar nuestros resultados al demostrar que durante la infección por ZIKV la proteína SYT9 sufre cambios similares a los descriptos anteriormente en relación a su expresión y localización subcelular, mostrando nuevamente una intensa co-localización con las proteínas virales NS1 y E de ZIKV en modelos de infección in vitro. Si bien otros estudios son necesarios para profundizar estos hallazgos, estos resultados son muy importantes dado que es la primera vez que puede asociarse una proteína de la familia de las sinaptotagminas con el ciclo de replicación de los FV. Por otro lado, también decidimos investigar la particular epidemiología de ZIKV. Principalmente, nos abocamos a estudiar las diferencias genéticas existentes entre las cepas de linaje Asiático responsables de las epidemias por ZIKV y las cepas pre epidémicas tanto de linaje asiático como africano (los 2 únicos linajes descriptos para ZIKV). Además, también estudiamos si las cepas epidémicas responsables de los casos asociados a neuropatologías (principalmente microcefalia) poseían variantes genéticas únicas respecto a las demás cepas epidémicas asociadas a casos sintomáticos más leves. Para ello, generamos una base de datos con secuencias genómicas completas de ZIKV que se encontraban disponibles en repositorios digitales. Luego, desarrollamos un algoritmo bioinformático para comparar las secuencias asiáticas epidémicas con los demás grupos, y registrar todas las variantes nucleotídicas así como información relevante asociada a estas variantes, incluyendo: sus posiciones en el genoma, sus consecuencias traduccionales y la frecuencia de cada variante dentro de cada uno de los grupos de secuencias mencionados. Posteriormente, evaluamos la distribución de estas variantes en el genoma de ZIKV para determinar si existían genes con diferente tasa de variabilidad. Además, analizamos en profundidad la frecuencia de cada variante, con el objetivo de encontrar variantes que fueran comunes a todas las secuencias de un determinado grupo de aislamientos de ZIKV. Finalmente, estimamos el impacto de estas mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas virales utilizando como parámetro la variación de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas (ΔΔG) y realizando un modelado proteico de las variables más relevantes epidemiológicamente. De esta manera, logramos identificar varias nuevas variantes genéticas que afectarían la estructura de las proteínas virales y que, a su vez, están presentes en todas las secuencias de los aislamientos epidémicos, pero en ninguna de las secuencias pre epidémicas. Estos datos podrían servir como un importante punto de partida para futuros estudios biológicos para comprender fehacientemente el impacto de estos cambios en las características de las cepas emergentes. En resumen, teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo de Tesis Doctoral podemos concluir que el mismo aporta al conocimiento integral de los mecanismos subyacentes a las particularidades biológicas y epidemiológicas demostradas para un virus con impacto importante en la salud pública regional. Durante este trabajo, fue posible mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos patogénicos que ZIKV utiliza para diseminarse dentro de su hospedador. Además, fue posible identificar potenciales factores celulares que el virus necesitaría para completar su ciclo de vida durante el curso de una infección y que podrían interpretarse como potenciales blancos terapéuticos en futuras investigaciones. Por otro lado, con este trabajo de tesis también hemos aportado a dilucidar las razones por las cuales este virus podría haber logrado desarrollar la última epidemia en América. Esto último nos permite conocer mejor la biología de este virus y sentar las bases para una mejor estrategia preventiva en caso de nuevas emergencias por ZIKV.application/pdfspaembargoedAccessZikaUniones intercelularesSYT9BioinformáticadoctoralThesisLeiva, Santiago GabrielUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina (CC BY-NC-ND 2.5 AR)